色谱峰,色谱柱及参数

柱效计算柱效Inr-n-iraunahT侦 20柱效他'用是指上桦板数，这村湛花方法是MWiii和提由.*的,他］|J把被分析物在两相之间的平衡和分简理论联系在一起，使川这肿方法把色谱柱分为若干理论上皆板数，样品组分在柱内每一个塔板的I古I工相和流动相之IT避”一次平衡，所以色谱柱的塔板数越筝平役」的次数也越多，分离的机会也越多言理论塔板高度越小分离庄越好匚I、何剑出了il•算柱效的公式，他们是从分阮丁里治和随机统i卜学推倒出'米的，XJ4.6x100nun5山2填半|的芭谱柱典槊柱效在-0005-J8000塔板.数之问,1【然.牛谱峰的矫板数雌有分散性越小。理论塔板数常用「加给定方法的色谱杵确定乓*士效，方法的并发器要决定当色谱柱的柱效降低到某一预定数值之加就不能再用，这时就要更换新的Si普柱了.

峰的耐称性在理想的情况|七色堵蜂应该是儿斯峰或对■称蜂.但是由于起柱效J立、样囱在固定和I一的吸附或鱼磨柱床不il；常,使色谱峰出现拖孔山以使用不对称公术计算色潜峰的不对称撤，|一住|所列公升於在分析e所用公忒的一种，和柱效的公式一样，.打法认迎人员⑴以决定当不对称度超边某--数值时这--方法无效。-般'与不对称度是3成更高时就不沽合-丁积分和定y分析』分离度总起来而，也响色畦峰之间竹肉度的因素有三个.它们是容量，柱效和选抒性。提高柱效、z色懵衅尖说.主我是色谱柱长度、类型、和颗粒度太小控制这-1大1察、牌加*遂，k\足使色谱峰的保留时间长一些狂足短-些.主要是流劫和仰温度控制以-因素n提Rj选择性，CC,是彳吏色谱彼此靠近-蛀枣是距离远-播L主理是姓含相、流动相和温度控制这-闰索n

5翌m和3.5-gm色谱柱的近似的塔板数(N)和死体积(Vm)编短柱LHnJ)同时减小粒度(NJ)能：-保持分离度-缩短分析时间-诚少溶剂用.最Co-tumnSizeParticleSizePlateNumberfN)VoidVolumiefVm,}4,6x250mm20,0002,5mL4»6x190mm5Tim12P0001.5mL4,€x150mm3.5.mR^pldResolution20.000185rtiL4.6乂75mm3.5-^mRapidRe^dliJtidin10.0000.75mL4.目x50mm3.5-aiTiRapidResalution6.0000.5mL4,6x30mmMS.tfliRapidResolutloin3.6000,3mL4»6x15mm3.5^m Re^olutioin2.0000.15mL上面的图表说明减小颗粒度即使缩短柱氐仍可以保持原有的柱效，4.6x250ininp5口山色:菩柱和4.6K15。nmi,3.5gm色讷柞都具有20.000塔板数，其优点是降低分析利间廿-约溶剂“注3.5 颗粒度的燃料可以使用2pm的沙芯过滤暮这一坟油每比便用O.Sptn过渡塞的优点是不易被小颗粒杂质堵塞■色谱柱直铎保留值和V.降低峰容税就降低g 5 5(ML)(mL) k=1k=3k=54.6X150mm 1.50 114229343i.OmL/inln X3.0X150mrn 0.64 4^921370,4mL^mln \2.1K150mm 0.2S 234^\g..2^5...JI.AfmiilugF.■邛土. 虹.:-iIL"U・MF'Mdp 10上面的数据说明从小内役色潜柱洗脱出来的色谱峰其面很小、峰扩散也很小.闵此被稀释的梆度很小-死时间（deadtime,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积（deadvolume，V0）--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0=FXt0（F为流速）典型的流速ColumnLd.(SuePairticles)FlowmL/min4.61-2主00.4-0.S二］U2-0.41心005-0.09IFlowRatelltw„|1IIT1lb-冒口…山皿FlowRateDrl1|lnalcclumn装填5呻l土朝：ll均4.6imni.d.色普柱&流速为L5niL/tiunl：d町得到最高的」苔板数，具有不同内径色谱柱要保持只有同样的流速*以横』如仆匕〔或柱箭的平方）来调节流速，如1：图所示“这样，M2.11111U内径的色职切装5inn址料，1-5niL/min的流速为312|.LL/iiiinT这和当于 mmi_d_色谱柱流速的20% 个•部分•析E间为Smill1mm1孔色谱杵只需整1.5niLT而iiirnm.色诺柱需戏7.5ml..这样-来就M少使用溶剂利处」里济剂反相HPLC的保留次序样岫分子的结构会为你提供•个洗脱次片的线索，洗脱次净受分r在水中浒解度和含碳含y的控制，观察至u的控制样m沈/兑次片的七215） 在水容斜皮越小保留伯:越大。216） 分于中碳数多保阴佰就增加。217） 支谜化合物的保留伯低于共木构异构体。218） 不和化合4勿保留伯降1氐°219）•般的流；H次行为:脂肪族＞I秀导仙极A永久仙极A狷碱A狷酸A酒酸。肉于型化合物•般以色i着壮死体积伏佥流；I"流动相洗脱强度反相HPLC所用溶剂洗脱强度.水段冲剂•水•甲醇•乙腊.异丙敢•四氢峡喃反相色谱的流动相常含仃水和缓冲溶液和能与水混溶的仃机溶剂，水或水J缓冲溶液是最弱的流动相，在分离中性化合物时不需要添加缓冲溶液，句机溶剂强度比水大，在流动相中增加有机溶剂的量将会使样品更快地洗脱出色谱柱,流动,相中J曾加水的含量会增加样品的保留时间,改变流动相中的仃机组分会改变其选择性,因而也改变样品的洗脱次序。选择键合相反相色谱柱r.H即□项以.:电r.-i氏保■性跳眼,说水.FH住柱的设捽馈网性,保脂惨比06小'、、fl—si-c^si-r/CHJC0CH3E.L盘脱得定憧撞7,保包性星一些gCNor(CH^CN帆基，刖性很强,最常用的IR性项棚也诰垣牌NHaor[CIHJaNH,甜混合功腿团的好划定相.腕乾附盈子交毓1.««»柱聚合枷F◎逸梓性差别聚章己母一二己毋基茉pin-1土稽定.柱放趣AmImTtKhw厨innMvi叫rf1g1』在反和色饴柱中键合相填料有明显的差别，到目前为止，最常用的反相色梏固定相是卜八烷基健合硅胶，C-18,它是一种耐用和保留性能强的固定相，C8类似于C-1&H是保留值小一些，偶尔出现C-住和的保留次序有所不同.但并非总是如此，短i.4®C-3,C-4,木如前者稳定，但是常用于肽和蛋白质的分析，苯基、毓基，和基基柱.与C-18相比，彼此之间具有不同的选择性。氤基柱对不同极性基团的化合物很有用，是很耐用的色渚柱〜氨基柱不够稳定，传统上它是分肉-碳水化合物或"袖”的色谱柱口苯基柱的极性强于C-18或C-8,H一电子云提供『和芳香族化合物作用的条14以聚合物为基的色谱柱人们知道它在宽的pH范围内能保持蔺定，但是它的柱效不如以硅胶为域的色谱柱,到现在为止•讨论集中在反相HPLC分离中性化合物上，反相HPLC也是分离离子型样品极好的方法。在溶液中的弱酸叮以中性或离子形式存在，在离解时成为负离子，在高pH介质中分子呈负离子状态，在此状态下分子主要为亲水性，所以分子的保留值很低，对某些分子在此情况下可以说完全没有保留作用0当流动相的pH降低到样品的pK时，分子就同时存在中性和离了两种形态，流动相的pH接近于样品的pK时，估计色谱峰会变宽而目.峰形难看，当流动相的pH比pK低1.5到2个单位时，分子呈中性，在此情况下分子的疏水性强，保留值最大。一般上，色谱工作者把流动相的pH调节到使分子呈中性，使其保留值达到最大而1L保留时间的精密度高，所以色谱匚作者把流动相的pH调节到比弱酸的pK值低2pH单位，这--技术叫做离子抑制方法。但是，你必须讪住对以硅胶为基的键合固定相的安全操作范围是pH2到8,在极端pH条件卜色谱柱的使用寿命会受到威胁。

保留值是pH的函数tarorrtiyIfe 4这一张图说名弱酸或弱喊如何随流动相的pH变化保留值的改变。要注意在pH接近弱酸或弱碱的pK值时变化最历害，这就是说pH稍仃变化，保留值就会仃很大的改变。如果在靠近弱酸或弱碱pK值处保留时间的重矩性就不好,峰形也变坏。离解的酸从色谱柱中很快地流出，与离解的酸不同，质子化的硬保留时间很长而目.峰性不好，这是由于和残余硅醇基作用的缘故，但是碱性化合物不能总是在离了抑制条件卜进行分离，分析T.作者必须提高pH使分子呈中性，但是在高pH卜的流动相会损坏硅胶基质的色谱柱，硅胶在pH8以上很容易溶解°但是"一些硅胶基的色谱柱在此条件卜性能比一般硅胶基色谱柱要稳定。以聚合物为某的色港柱是另外种抗高pH介质的固定相。使用预柱使流动相使被溶解的硅胶得到预饱和，以便减少对色谱柱的损坏。缓冲溶液缓冲溶液PE缓冲范围缓冲癖波叫缓冲范围磷酸盐甲酸盐3S2S-48PK12.11.1-3.1乙酸给4.83.8-58pK27.26.2-8.2Tris（羟乙基氨基甲pK312.311.3-13.3烷）8.37.3-9.3氨9.282-102柠檬酸盐训酸盐9.28.2-10.2PS3.12.1-4.1毗咯烷10.595-115pK?4.73.7-5.7PK35.44.4一6.4其他常用流动相添加荆•乙酸.碑酸•硫酸•三fit乙«CIFA)为了控制弱酸和弱碱的保留时间，流动相的pH必须严格控制，必须要选拜适当缓冲溶液体系并精心地制备缓冲溶液，上表列出些HPLC常用的缓冲溶液，一种特殊的缓冲溶液只在一定的pH范围是稳定的。缓冲溶液要有足够的浓度，但不要过度，•般HPLC的缓冲溶液浓度范围在25到100inM,应当使用质量最好的试剂制备缓冲溶液，使用经过校准的pH计滴定缓冲溶液到指定的pH,或者使用制备的缓冲溶液。要把缓冲溶液进行过滤除去任何颗粒物质・要把缓冲溶液冷冻保存，或在使用时再制备，因为许多缓冲溶液会促进细留的生长。缓冲溶液类型对色谱柱稳定性的影响05MB1OM19M(I2MIM25l® 0 50M 100®15WG3C€CC2S®3K»O3unn诫州inw5Purge CokrrmWnmesoiPiiw色请柱：4fix]MlnunZorbaxXDB-CE:冲洗：20%ACN/B0*?4>0.25M缓冲液.pH7:1.0inl/nuii;Test:60^bACN/W%0.01M嶙酸钠暖冲溶液、pH7.031.5luL/hiid;22°C.，『；*■，.IwMlirnheW雨W T上述数据说明缓冲溶液的选择能影响色落柱填料的寿命，虽然柠檬酸盐缓冲溶液对色漕柱寿命要好于埔酸盐，但是柠檬酸盐对仪器的不锈讷零件有腐蚀作用。受记住在不用仪器叶-定要把缓冲溶液从色谱柱和仪器中冲洗出去，当流动相中含有缓冲溶液叶停流是极」彳•的条件，高温卜-使色谱柱和其他仪器部件暴本在流动相和添加剂中，也会加速它仁的损坏，含盐缓冲溶液的流动相「-万不登■■上它在泉系统中蒸发T，这杆•会损坏R例阀、泉的峦封件、活塞：引入新的流动相会使其永久性的堵塞。缓冲溶液小可能i再溶解科沉淀°弱碱的分离胺在硅醇基上的第二次保•Si-0-+R•Si-0-+R3NH+-Si-O+HNR3强作用三乙胺眠嚓TEMEDDMOA•Si-OH+三乙胺眠嚓TEMEDDMOA•Si-OH+R3N-Si-O+HNR3缓冲溶液太低射®（剂不够强与稚醇基进行竞争在固定相表而上的游离硅醇基造成不希望有的和碱的第二次作用，顶部的色谱图说明弱碱与游离硅醇基典型的作用，样品有很强的保留作用，峰形也不好。如果加入一个比样品更容易和游离硅醇基作用的化合物，就可以消除硅醇基•碱的作用，常用的这类改性剂是三乙胺（TEA）,TEA叫做动态封端试剂或保护试剂，典型的情况下加入10-30】nM的量就可以减轻或消除这种作用。在上面的例子里，第一个图的流动相中只简单地含有磷酸钠，第二个图用哌嗪做封端试剂，但是它的作用不明显，在第三种情况下使用TEMED（NgN'N'•四甲基乙二胺）做保护试剂，得到好的结果，但是TEA是更常用的这类试剂。

反相色港分离离子刈样品弱碱的分离弱酸■改变pH进行分离0.120.100.080.060.04反相色港分离离子刈样品弱碱的分离弱酸■改变pH进行分离0.120.100.080.060.040.020.000.100.060.060040.020.00利尿剂1典氯毗眯

■啡因3苯唾pH11BA •色谱柱：，6x150nmi.ZorbaxXDB-C8,流速:1.0niLoim:24。C•渣动相：A:35%\feOH/45%0.025M磷很纳溪冲液,pH3.0B-55%MeOH.45%0.05ML甲基utR$-HCl绥冲液.pH11.00 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20：£；：AilcMlUdnmilo上面的例子提高流动相的pH到某-程度时，碱不再能质子化，减弱了碱和游离硅醇基的作用。要说明的是对多数色i普柱并不推荐这样做，在pH高到8以上时会溶解硅胶而损坏硅胶基的色谱柱，徉流动相中加入三乙胺或使用封端色i普柱则是明智之举。分离弱酸和弱碱分离弱离子化化合物的试验条件分离参数开始的选择色语拄尺寸15(或25)x0.46cm.5或3.5pmC18或C8流动用溶剂A和B水缓冲溶液贝CN变散(k=05-20)缓冲洛波25mW染酸钾.pHW3添加剂25-50mMTEA或TEA乙般拄,如需要流速1-2mbmin4TC体积<50pL工¥AeebulU<H«oIh0«<26pg12上面总结了分离含有朋酸和翡碱样品的条件，流动相和添加剂不会影响中性化合物。梯度方法的建立:Rs=1（冬瓦上）4a1+kk="/1.15V△中）Rs：分离度，表示两峰分离程度的物理量。k：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。一种物质的k值是恒定不变的。上面两试针对的是梯度洗脱，k表示的平均容量因子。a：分离因子，两个溶质的容量因子的比。通常k大的作为分子。表示两物质分离能力的大小。N：理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。tG:梯度时间；F：流速；Vm:死体积；△①：梯度变化范围。常见问题和维护：整个液相系统最值得关注的常数：压力除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。压力来源：泵上的压力传感器最常见的问题：压力小（几乎为零）：说明没有流动相流过柱子。可能原因：柱前漏夜流速设为0了流动相干了吸滤头没有放流动相液面之下流路中有大段气泡处理方法：漏液：从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查。泵上有自己的漏液传感器。检测到漏液。会停止工作并蜂鸣，变红。同时显示错误信息：ERROR：LEAKDETECTED。发现漏液点，先停泵，重新接好。将漏液擦干。有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。流路中有大段气泡：通过大流速（如5ml/min）冲洗可以去除泵体内气泡。也就是常说的PURGE。按下泵的面板上的purge键即可。每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。通常不改。初始值应该是5ml/min，3min。但有时候泵体内空气太多，purge都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在purge的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。直到没有气泡。关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：有脱气机在。在purge时，由于流速太大，难免会出现气泡。尤其是在purge阀开超过180度，废液出口处出现气泡就跟平常了。只要气泡不在泵腔内堆积，就几乎不会影响到分析结果。只要出了泵口，在高压下会被压缩的很小。不影响流路的延续性。所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。在泵体内有气泡堆积时，压力波动会变大。什么样的波动算正常，需要大家注意观察。根究经验，在以恒定流速，梯度不变时，面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。吸滤头堵，管路脏（通常是水相）有可能带来频繁出现的气泡。可以先A，B的溶剂瓶调换一下。PURGE三五次。后换回来，再PURGE两次。清洗一下管路。压力过大：说明流路堵了逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵）断开，以一定流速走：压力正常，说明是柱子及其后的某一段堵了（通常是柱子）。换柱子（或预柱）。压力还高：说明是柱前某段堵了。这时再将进样器出口（接柱子）的peek管接头拧下：压力正常：说明是这段peek管堵了。换peek管。压力还高：说明是进样器之前的部分堵了。通常是进样器六通阀堵了。反冲或清洗流通阀。其它部分依次类推。压力波动大：说明流路中的液流不平稳，这时色谱图通常保留时间不稳定，峰型也不好。得到的线性，重复性也不会好。可能原因：泵体内有气泡，泵头单向阀坏。先确认是哪一台泵有问题。先走100%A相。看是否压力还是波动大，还大则说明A泵有问题。压力正常则说明A泵正常。再走100%的B相，过程如上。确认好泵之后，先purge一下，以驱赶气泡。Purge两次后，还是压力波动大，这有可能单向阀坏了，需要清洗或更换。Ctc自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作）：换针：调针位：调针位：设定洗针体积：一些小概念：PEEK:聚醚醚酮色谱管道，外径多为1/16inch,1inch=2.54cm,1/16in=2.54cm,内径大小以颜色标准，红色（我们用的）最小，为0.13mm（应该是国际统一标准）PEEK接头手紧即可不锈钢接头要用工具紧接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。后者在拧紧的过程中，不易带动管道扭曲变形。不锈钢的压紧环是一次性的单位换算：1MPa=10bar=Psi:poundpersquareinch（psi）Torr:托里彻利，标准大