传染病暴发疫情应急检测

传染病暴发疫情

应急检测当前第1页\共有70页\编于星期五\17点一、实验室检测在传染病疫情中的作用公共卫生疾病预防控制体系应急反应体系医疗救助体系卫生监督执法体系四个体系教育培训人才队伍公共卫生立法运行保障科研工作依托——国家突发公共卫生事件应急预案当前第2页\共有70页\编于星期五\17点一、实验室检测在传染病疫情中的作用传染病暴发疫情处置流程当前第3页\共有70页\编于星期五\17点一、实验室检测在传染病疫情中的作用当前第4页\共有70页\编于星期五\17点传染病疫情的核实、处置、总结评价等方面离不开实验室检测结果的支持。如传染病的诊断应包括流行病资料、临床病史、体格检查和实验室检验结果等，再者病原体的检出是确诊传染病的主要依据。一、实验室检测在传染病疫情中的作用当前第5页\共有70页\编于星期五\17点二、标本采集与运输临床标本的采集可以分为：用于病原分离或检测抗原用的标本，包括粪便、咽拭子、痰液、尿液、血液、脑脊液等；用于病原抗体检测的标本，通常包括急性期和恢复期血清、脑脊液。尸体标本：采集有病理变化的脏器或组织。注意无菌操作，尽量避免污染。当前第6页\共有70页\编于星期五\17点

1.粪便标本采集病人发病7日内的粪便标本用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内并密封，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（一）标本采集当前第7页\共有70页\编于星期五\17点

2.肛拭子

采集病人发病7日内的肛拭子标本用于病原检测。用采样棉签沾取少量生理盐水，适度用力插入患者肛门，同一方向旋转采样棉签，取出棉签放入装有3～5ml保存液（维持液、或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。当前第8页\共有70页\编于星期五\17点

3.咽拭子

采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签,适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位,应避免触及舌部;迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖并密封。当前第9页\共有70页\编于星期五\17点

4.疱疹液局部皮肤消毒后(建议使用75%酒精,不能使用碘酒),用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装3～5ml病毒保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。可同时采集同一病例的多个疱疹作为一份标本。当前第10页\共有70页\编于星期五\17点5.血液样本的采集：作血液病原培养、核酸检测时,严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无菌的有螺口的抗凝的容器或培养瓶中送检。6.血清标本：采集急性期(发病0～5d)和恢复期(发病14～30d)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时,采集(发病7～20d)血。静脉采集3～5ml全血,置于真空无菌采血管中,自凝后,离心分离血清于无菌带垫圈的血清管中,旋紧管盖并密封。当前第11页\共有70页\编于星期五\17点7.脑脊液标本：出现神经系统症状的病例,要采集脑脊液标本,进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内,采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的血清管中,旋紧管盖并密封。8.尿液采集：中段尿采集法，先用肥皂水清洗外阴部，再以无菌水洗净，一般取首次晨尿的中段尿10～20ml于无菌试管内。

当前第12页\共有70页\编于星期五\17点9.尸体标本的采集：取尸体标本时每个标本用单独的无菌活检针至少取1～2g感染部位标本，放入单独的装有相应培养基的无菌容器中。当前第13页\共有70页\编于星期五\17点（二）标本运输所有采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室,如不能立即运送，用于细菌分离培养4℃保藏，病毒分离－20℃以下低温冷冻保藏。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融,如果不能确保－20℃的条件，应该在0～8℃运输和保存。标本运输时要附有采送样登记表，包含必要信息,如标本编号,发病日期和标本采集日期等。当前第14页\共有70页\编于星期五\17点三、现场快速微生物检查方法直接从临床标本中检查微生物抗原检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物快速检出细菌的毒素微生物快速检测仪器

当前第15页\共有70页\编于星期五\17点三、现场快速微生物检查方法

炭疽杆菌抗原检、抗体测试剂（胶体金法）土拉热菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）鼠疫菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）布鲁氏菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）A型肉毒毒素检测试剂（胶体金法）B型葡萄球菌肠毒素检测试剂（胶体金法）沙眼衣原体、肺炎支原体、出血热等快速检测试剂优点：检测速度快缺点：假阳性率高当前第16页\共有70页\编于星期五\17点三、现场快速微生物检查方法直接涂片染色后镜检适用于形态和染色上具有特征性的病原菌。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脓液中发现革兰氏阳性葡萄串状球菌，咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆菌及霍乱弧菌、艰难梭菌等。优点是方便快捷，缺点是适用范围小。当前第17页\共有70页\编于星期五\17点四、实验室检测方法1.病原分离细菌的分离培养有正常菌群存在部位所取标本（如粪便），应接种至选择或鉴别性培养基。无菌部位采集的脑脊液、血液等标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。当前第18页\共有70页\编于星期五\17点细菌的鉴定生化鉴定：生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方法之一，如糖发酵试验；现有多种微量、快速、半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器,极大方便了菌株鉴定工作.血清鉴定与分型：利用已知的特异抗体的诊断血清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集实验，在数分钟内能可得出结果。当前第19页\共有70页\编于星期五\17点缺点：耗时长（需48～72h），过程繁琐。优点：能获得病原菌，特异性为100%，是许多细菌性传染病实验室确诊的最重要证据。因此，在暴发疫情中要求尽可能进行病原菌分离来获得实验室确诊证据。当前第20页\共有70页\编于星期五\17点病毒分离培养鸡胚培养动物接种组织培养当前第21页\共有70页\编于星期五\17点病毒分离（细胞）

鉴定的一般流程PCRRT-PCR/sequencingTaqManRT-PCRDNAmicroarrayNASBALAMP……结果判定接种细胞阴性结果判定标本采集细胞病变病变观察(连续3代)标本处理细胞无病变ELISA检测免疫荧光中和试验血凝及抑止试验补体结合试验...血清学鉴定分子生物学鉴定蚊虫标本、血清、CSF、尸检组织标本鉴定当前第22页\共有70页\编于星期五\17点病毒形态学鉴定观察CPE，常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。正常细胞病变细胞当前第23页\共有70页\编于星期五\17点A：正常Hep-2细胞；

B：发生CPE后的Hep-2细胞；C：正常RD细胞；

D：发生CPE后的RD

细胞当前第24页\共有70页\编于星期五\17点2.核酸检测

RT-PCR检测方法

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。当前第25页\共有70页\编于星期五\17点PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史。1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制。PCR的改进与完善DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段T4DNA聚合酶耐热DNA聚合酶(一株水生嗜热杆菌中提取)PCR仪当前第26页\共有70页\编于星期五\17点用途广泛：生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖当前第27页\共有70页\编于星期五\17点RT-PCR基本原理逆转录酶DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增当前第28页\共有70页\编于星期五\17点提取核酸模板（病毒RNA模板为例）RNA提取试剂盒方法试剂准备(按照试剂盒说明书操作)：aCarrierRNA储存液配制：CarrierRNA冻干粉溶解于无RNA酶水中，储存液的浓度一般为1ug/uL，并进行分装，避免反复冻融。bCarrierRNA工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液RL和CarrierRNA溶液的体积，将裂解液RL与CarrierRNA溶液颠倒混匀，即得到CarrierRNA工作液。最好现用现配，工作液2-8℃保存不超过48小时。c缓冲液GD、漂洗液RW为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存1年。当前第29页\共有70页\编于星期五\17点提取病毒RNA模板：吸取560µl含有CarrierRNA的RL到1.5mlEp离心管中。加140µl1标本到上述离心管中，回旋振荡15秒。室温（15～25℃）孵育10min。短暂离心一次。加560µl乙醇（96～100％）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡15秒。短暂离心一次。从离心管中吸取630µl溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，6000g（8000rpm）离心1min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。加500µl缓冲液GD，6000g（8000rpm）离心1min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。加500µl漂洗液RW，6000g（8000rpm）离心1min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。13400g（12000rpm）离心3min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。将吸附柱放入一个新的1.5ml无RNA酶离心管中，加入60µlRnase－freeddH2O，盖上盖子，在室温孵育5min，6000g（8000rpm）离心1min。提取的病毒RNA模板可立即进行逆转录，或贮存于－70℃备用。当前第30页\共有70页\编于星期五\17点全自动核酸提取简介当前第31页\共有70页\编于星期五\17点当前第32页\共有70页\编于星期五\17点当前第33页\共有70页\编于星期五\17点当前第34页\共有70页\编于星期五\17点当前第35页\共有70页\编于星期五\17点当前第36页\共有70页\编于星期五\17点RT－PCR反应条件:50℃40分钟；94℃5分钟；94℃30秒，50℃40秒，65℃50秒，35个循环；65℃10分钟。（总时间约170分钟）当前第37页\共有70页\编于星期五\17点电泳分析结果用1×TAE配制２%的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入GOLDVIEW(５ｕＬ/100mL),待凝胶冷却至50～70℃左右，倒入胶槽，等胶凝固后放在电泳装置上；在帕拉膜（Parafilm）上加上6×电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；盖上盖子，接通电源，以5V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；当前第38页\共有70页\编于星期五\17点5.在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。当前第39页\共有70页\编于星期五\17点RT-PCR质量控制提取RNA：选择一个EV71阳性标本同时提取作对照；PCR扩增：选择至少一个EV71阳性标本RNA同时扩增作对照；电泳分析：选择合适的Marker（500～1000bp)当前第40页\共有70页\编于星期五\17点实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。当前第41页\共有70页\编于星期五\17点分类(DNA产物的荧光标记)：

非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen

特异性荧光标记：

2、TaqMan

3、分子信标

(MolecularBeacon)当前第42页\共有70页\编于星期五\17点TaqMan---水解型杂交探针

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等；

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)；探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光；

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针。当前第43页\共有70页\编于星期五\17点TaqMan法工作原理当前第44页\共有70页\编于星期五\17点TaqManPCR体系的构成：引物、TaqMan探针、dNTPs、Taq聚合酶、模板、相应的缓冲体系等。当前第45页\共有70页\编于星期五\17点典型的RealtimePCR四阶段:

当前第46页\共有70页\编于星期五\17点荧光阈值(threshold)设定:threshold=10×SD(cycle6-15)当前第47页\共有70页\编于星期五\17点Ct值：

C代表Cycle,t代表threshold,即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。当前第48页\共有70页\编于星期五\17点荧光定量PCR标准曲线绘制:当前第49页\共有70页\编于星期五\17点结果分析条件设定和结果判断:对照结果：阴性对照应为阴性；阳性对照应为阳性；Ct值无数值的（与阴性对照应一致）标本为阴性样本；Ct值≤35.0的样本为阳性；Ct值≥35.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。当前第50页\共有70页\编于星期五\17点荧光PCR特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过程，无需后处理，降低污染机会。即时反映扩增过程，更适用于定量。可实现一管多检（如：双通道、三通道检测）仪器自动分析，更快获得结果。探针设计有一定难度，较难达到一管多检的要求。出现污染，更难处理。当前第51页\共有70页\编于星期五\17点3.血清学方法ELISA－酶联免疫吸附试验底物（TMB）酶标二抗病毒特异性抗体病毒分离物（抗原）

ELISA用于检测病毒分离物，既可以鉴定病毒种类，也可以鉴定出病毒的血清学亚类。本方法的特异性和敏感性都比较高，而且适用于大量的样本检测，这对于新分离病毒的初步鉴定工作具有非常重要的意义。当前第52页\共有70页\编于星期五\17点TypesofELISA:DirectELISA;IndirectELISA;Sandwich/CaptureELISAABasicELISACoatingantigenBlockremainingbindingsitesWashoutexcessreagentAddingsamplesAddingsubstrateReadingPrintingresultsAddingsecondaryantibody当前第53页\共有70页\编于星期五\17点注意事项待检病毒分离物在检测前需要56℃，30分钟进行灭活；所有使用的抗体在－20℃条件保存，若短期内（1～2周）经常使用，可暂储存于4℃，避免反复冻融；加样时，按规定的量加到微孔板孔的下1/3处，应避免溅出和产生气泡；加每份标本应更换吸头，避免交叉污染；温育时，最好使用水浴法或湿盒法，避免产生边缘效应；微孔板不可叠加放置；测OD值前将微孔板底部的水吸干，避免OD值出现负值或损坏滤光片；移液枪的加样误差一般应在±10％以内；水浴箱允许有±1℃的误差；洗板机洗板后的残液量一般不超过2μL，达到人工扣板不湿即可；酶标仪经常维护光学部分，防止霉变，并且定期检测校正；ELISA鉴定病毒的程度依赖于抗体的特异性程度病毒组特异性抗体——病毒属/组病毒特异性多克隆抗体——病毒种（易受血清学交叉反应影响）病毒特异性单克隆抗体——病毒种类病毒血清型特异性抗体——病毒种类及血清型别当前第54页\共有70页\编于星期五\17点IFA－免疫荧光技术

免疫荧光技术于1942年发明，该技术在医学和微生物学研究中的应用越来越广泛。间接免疫荧光法具有安全、快速、简便、结果直观、敏感性和特异性较高等优点，它同样可以检测病毒种类和亚类。IFA检测病毒分离物示意图FITC标记的抗IgG抗体特异性病毒抗体细胞内的病毒当前第55页\共有70页\编于星期五\17点IFA鉴定病毒的程度依赖于抗体的特异性程度当前第56页\共有70页\编于星期五\17点注意事项：制片时感染病毒的细胞生长不宜过密，在试验操作过程中，切勿损伤细胞；每次试验必须设立严格对照；不要正对着抗原片的孔冲洗，以免将细胞冲落；荧光标记抗体的浓度要合适，过高会造成非特异性荧光；荧光染色标本完成封片后，应立即镜检，若没有立即镜检的条件,或要保留备查,应将标本置于4℃、密闭、避光等；观察荧光时，要将细胞形态学特征和特异荧光的强度结合起来综合判断，不可偏废；当前第57页\共有70页\编于星期五\17点中和试验

中和试验是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。中和抗体是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。当前第58页\共有70页\编于星期五\17点未知病毒的鉴定过程与方法现场流行病学提出病原学假设病毒类细菌类寄生虫类。。。标本采集病原分离光镜电镜免疫学方法分子生物学当前第59页\共有