高二生物山东专版选修13讲义2.1DNA重组技术的基本工具

2．1DNA重组技术的根本工具1.基因工程的根本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论根底是密码子的通用性。2．DNA重组技术的根本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。3．限制性核酸内切酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。4．E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。一、基因工程的概念[填表]别名DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平结果制造出人类需要的新的生物类型和生物产品二、基因工程的诞生和开展1．根底理论的突破：DNA是遗传物质的证明；DNA双螺旋结构和中心法那么确实立；遗传密码的破译。2．技术的制造：基因转移载体和工具酶的相继发觉；DNA合成和测序技术的制造；DNA体外重组的实现及重组DNA表达试验的胜利；第一例转基因动物的问世及PCR技术的制造。三、DNA重组技术的根本工具1．限制性核酸内切酶(又称限制酶)(1)来源：主要来自原核生物。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)结果：产生黏性末端或平末端。(4)应用：限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同〞或“不同〞)，说明限制酶具有专一性。2．DNA连接酶(1)作用：将双链DNA片段“缝合〞起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)种类：[填表]种类比拟E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能连接黏性末端既可以连接黏性末端，又可以连接平末端3．基因进入受体细胞的载体(1)种类①常用载体：质粒eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(化学本质：双链环状DNA分子,特点\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(能自我复制,有一个至多个限制酶切割位点,有特别的标记基因))))②其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(2)作用①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(3)载体须具备的条件及其作用(连线)四、重组DNA分子的模拟操作1．所用材料用具中，剪刀代表EcoRⅠ，透亮?????胶条代表DNA连接酶。2．用剪刀进行DNA“切割〞时，应找出G—A—A—T—T—C序列并在G—A之间作切口进行“切割〞。3．假设操作正确，不同颜色的黏性末端能互补配对。1．基因工程是一种新兴的生物技术，实施该工程的最终目的是()A．定向提取生物体的DNA分子B．定向对DNA分子进行人工“剪切〞C．在生物体外对DNA分子进行改造D．定向改造生物的遗传性状解析：选D基因工程也称DNA重组技术，它是依据人类的意愿，将某种基因有方案地转移到另一种生物中去的新技术，故实施基因工程的最终目的是定向改造生物的遗传性状。2．以下关于限制酶的说法，正确的选项是()A．限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D．限制酶均特异性地识别由6个核苷酸组成的序列解析：选B限制酶主要存在于微生物中；限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列；不同的限制酶切割DNA后会形成黏性末端或平末端；限制性核酸内切酶均能特异性地识别核苷酸序列，但识别的核苷酸序列不肯定由6个核苷酸组成。3．“分子缝合针〞——DNA连接酶“缝合〞的部位是()A．碱基对之间的氢键B．碱基与脱氧核糖C．双链DNA片段间的磷酸二酯键D．脱氧核糖与脱氧核糖解析：选C相邻的两个脱氧核苷酸之间由磷酸和脱氧核糖形成的磷酸二酯键连接，DNA连接酶连接的是此化学键。4．以下通常不被用作基因工程载体的是()A．细菌质粒 B．λ噬菌体的衍生物C．动植物病毒 D．细菌核区的DNA解析：选D常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。细菌的核区由一个大型的环状DNA分子经反复折叠缠绕而成，它掌握着细菌的主要性状，一般不能用作基因工程的载体。5．质粒是基因工程最常用的载体，以下有关质粒的说法错误的选项是()A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制解析：选A质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。eq\a\vs4\al(核心要点一)eq\b\lc\|\rc\(\a\vs4\al\co1(,,,,,))eq\a\vs4\al(基因工程中的工具酶)1．限制性核酸内切酶(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②能够切割特定序列中的特定位点。(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原那么，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如eq\a\vs4\al(GC,CG)eq\b\lc\|\rc\(\a\vs4\al\co1(\a\vs4\al(GC,CG)以中心线为轴，两侧碱基互补对称；\a\vs4\al(CCAGG,GGTCC)))以eq\a\vs4\al(A,T)为轴，两侧碱基互补对称。(3)作用产物：黏性末端或平末端。①黏性末端：是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如下图：②平末端：是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如下图：2．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的关系(1)区分：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接(2)两者的关系可表示为：3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比拟比拟工程DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制[题组冲关]1．以下关于几种酶作用的表达，错误的选项是()A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链解析：选C限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请答复以下问题：限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ识别序列及切割位点图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。(2)假设BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________(填“都能〞“都不能〞或“只有一种能〞)切开。(3)假设用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。解析：(1)基因工程中选择适宜的限制酶切割质粒和目的基因时，应保存目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个〞的根本原那么，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以防止目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保存的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒。(2)由于BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为eq\a\vs4\al(TGATCC,ACTAGG)eq\a\vs4\al(\b\lc\(\rc\)(\a\vs4\al\co1(GGATCA,CCTAGT)))，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(3)由图可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点，假设将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，那么完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有三种状况，都产生一种大小的DNA片段，即大小均为a＋b＋c；考虑切2个切割位点，那么会产生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，假设用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。答案：(1)BclⅠ和HindⅢDNA连接(2)eq\a\vs4\al(TGATCC,ACTAGG)eq\a\vs4\al(\b\lc\(\rc\)(\a\vs4\al\co1(GGATCA,CCTAGT)))都不能(3)7[方法规律]限制酶的选择技巧依据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；③为防止目的基因和质粒的自身环化和随便连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)依据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶全都，以确保产生相同的黏性末端；②质粒作为载体必需具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；假如所选酶的切割位点不只一个，那么切割重组后可能丧失某些片段，假设丧失的片段含复制起点区，那么切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制eq\a\vs4\al(核心要点二)eq\b\lc\|\rc\(\a\vs4\al\co1(,,,,,))eq\a\vs4\al(基因工程中的载体)1．种类(1)常用载体：质粒，它是一种暴露的、结构简洁、于细菌拟核DNA之外，具有自我复制力量的很小的双链环状DNA分子。(2)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。2．具备条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。(3)具有标记基因：具有特别的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否那么受体细胞将受到损伤甚至死亡。3．作用(1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。[名师点拨]细胞膜上的载体与基因工程中的载体不同(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是帮助细胞膜掌握物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车〞，把目的基因导入受体细胞。[题组冲关]3．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓TTAAG—和—G↓AATTC—。如图表示的是四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影局部表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是()解析：选A目的基因两侧有MunⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列，用这两种酶切割都可得到目的基因，且未破坏标记基因的结构；B中质粒无标记基因，不符合作为载体的条件；C、D中的标记基因都会被破坏。4．(全国卷Ⅰ)某一质粒载体如下图，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，参加DNA连接酶进行连接反响，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。答复以下问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的根本条件有___________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满意上述根本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)假如用含有氨苄青霉素的培育基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其缘由是______________________________；并且__________________________和____________________的细胞也是不能区分的，其缘由是________________________________________________________________________。在上述筛选的根底上，假设要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培育基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________________。解析：(1)质粒作为载体，应具备的根本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特别的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培育基中参加氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培育基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培育基上存活，二者也不能区分。假设要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培育基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培育基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培育基上均能生长四环素(3)受体细胞[方法规律]载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有反抗相关抗生素的力量。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够反抗相应抗生素，所以在受体细胞的培育体系中参加该种抗生素就可以只保存转入载体的受体细胞，原理如下图：[随堂根底稳固]1．以下有关基因工程的表达，正确的选项是()A．基因工程是细胞水平上的生物工程B．基因工程的产物对人类都是有益的C．基因工程育种的优点之一是目的性强D．基因工程产生的变异属于人工诱变解析：选C基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切〞和“拼接〞，对生物的基因进行有目的地改造，然后导入受体细胞内，使目的基因在受体细胞内胜利表达，产生人类所需要的基因产物。因而基因工程是分子水平上的生物工程，其产生的变异属于基因重组，而不属于人工诱变；基因工程虽是依据人们的意愿改造生物，目的性强，但并不是全部的基因产物对人类都有益。2．有关DNA重组技术中的工具——“分子缝合针〞“分子手术刀〞“分子运输车〞的组合正确的选项是()①DNA连接酶②DNA聚合酶③限制酶④RNA聚合酶⑤载体A．②③⑤ B．①③④C．①③⑤ D．④③⑤解析：选C基因工程中，“手术刀〞是限制酶，“缝合针〞是DNA连接酶，“运输车〞是指将目的基因导入受体细胞的载体。3．以下有关限制性核酸内切酶的表达，正确的选项是()A．用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B．限制性核酸内切酶识别序列越短，那么该序列在DNA中消失的概率就越大C.eq\o(\s\up7(↓,－CATG－),\s\do5())和eq\o(\s\up7(↓,－GGATCC－),\s\do5())序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒解析：选B用限制酶切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需剪切2次，水解磷酸二酯键4个；限制酶识别序列越短，那么该序列在DNA中消失的概率就越大；eq\o(\s\up7(↓,－CATG－),\s\do5())和eq\o(\s\up7(↓,－GGATCC－),\s\do5())序列被限制酶切出的黏性末端均有4个碱基；切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，假如不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端存在互补关系，那么两末端也可连接。4．以下关于DNA连接酶作用的表达，正确的选项是()A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接解析：选BDNA连接酶和DNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成，但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶那么是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。5．以下四条DNA片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是()A．①② B．②③C．③④ D．②④解析：选D只有②和④的黏性末端的碱基都是互补的，它们可能是由同一种限制酶切割而成的。6．