DDP细胞顺铂敏感性的影响及机制探讨

声敏剂血卟啉对COC1/DDP细胞顺铂敏感性的影响及机制探讨声敏剂血卟啉对COC1/DDP细胞顺铂敏感性的影响及机制探讨

：周晓莉,唐良萏,王燕,彭丽钦

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声敏剂血卟啉对COC1/DDP细胞顺铂敏感性的影响及机制探讨

接灭活耐药卵巢癌细胞是医学工亟待解决的关键问题,更是肿瘤康复中提高女性生产率和改善女性生活质量的迫切需要。声动力疗法（SDT）是一种很有应用前景的治疗肿瘤的方法。大量讨论表明,超声加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比单独超声对肿瘤细胞更具有杀伤效果,血卟啉则无抗肿瘤效应［1,2］。有报道说这种杀伤作用机制是通过诱导细胞凋亡［3］。在本试验中,把超声激活的血卟啉联合顺铂作用于人卵巢癌顺铂耐药细胞,观看其杀伤的作用,以期降低卵巢癌对顺铂化疗的耐药。

1材料、仪器与方法

1.1材料

1.1.1试剂和仪器超声增敏剂血卟啉购自Sigma公司,注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司（国药准字H37021358）,四甲基偶氮唑蓝（MTT）、姆萨色素为Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理盐水配成5mg/ml的溶液,过滤除菌后4℃避光保存。超声装置为陕西师范高校声学讨论所研制,探头面积为4.7cm2.1.1.2细胞系及培育肿瘤细胞株为人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP（购自中科院上海细胞生物学讨论所）。COC1/DDP在含有0.5μg/ml顺铂的完全培育基（50μg/ml青霉素,50μg/ml链霉素和10%胎牛血清的RPMI1640细胞培育基）37℃,5%CO2常规细胞培育、传代。试验前1周换用不含顺铂的完全培育基培育。

1.2方法

1.2.1MTT法检测各试验组对COC1/DDP细胞增殖的影响把细胞制成单细胞悬液,以每孔0.2×104个接种于96孔板中,每孔200μl完全培育基。12h后进行试验干预,按以下分组进行试验干预,A组(对比组):单纯培育COC1/DDP细胞;B组(单纯顺铂组):在细胞中加入顺铂,顺铂选0.625、1.25、2.5、5μg／ml4个浓度;C组(血卟啉+超声组):血卟啉选0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml4个浓度,同时进行超声照耀60s;D组(顺铂+血卟啉+超声组):细胞液中加入顺铂和血卟啉,使其终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5μg／ml和0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml,同时进行超声照耀60s.每组设5个复孔,此时记为0d;于37℃、5%CO2的饱和湿度箱中连续培育和观看,于3d后取出96孔板,1200r/min离心10min.去上清,加入180μl完全培育基和20μlMTT,37℃连续培育4h,离心后当心吸弃上清。再加入150μlDMSO,振荡10min,充分溶解。选择490nm,在酶标仪测定各孔吸光率。试验重复3次。按下列公式求出增殖抑制率:肿瘤细胞增殖抑制率=［1(药物处理组OD值空白对比组OD值)／(细胞对比组OD值空白对比组OD值)］×100％.

1.2.2PI/Hoechst染色检测细胞凋亡状况细胞生长达80%融合时消化传代,以每孔0.3×104个接种于96孔板中,每孔200μl完全培育基。12h后进行试验干预,分组同前,72h后,每孔依次加入细胞染色缓冲液100μl、Hoechst染色液0.5μl、PI染色液0.5μl冰浴30min,PBS洗涤1次,再在荧光显微镜下观看。计数凋亡细胞比例。

1.2.3免疫细胞化学检测试验干预后COC1/DDP细胞内bcl2和bax表达的变化选取对数生长期的COC1/DDP细胞,制成单细胞悬液,按2×104/ml接种于24孔培育板,连续培育12h后按前述方法进行分组处理。各组细胞经试验处理后置于37℃,5%CO2孵箱中连续培育8h,收集细胞,涂布细胞于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上,室温风干,纯丙酮室温固定30min.按免疫组化试剂盒使用说明书分别进行:纯甲醇加过氧化氢至0.5%,室温30min以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤后，滴加

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免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗体,置湿盒中37℃,20min,0.01NPBS洗2min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置湿盒中37℃,20min.0.01NPBS洗2min×3次后滴加SABC37℃,20min,0.01NPBS洗5min×4次后，DAB显色10min,蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染、脱水、透亮     、封片。光学显微镜下观看细胞浆着色呈棕黄色的为阳性细胞,每张片随机计数3个视野,每样品取5张片的平均值为阳性表达率。

1.3统计学方法

所获试验数据均以均数±标准差(±s)表示,采纳SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析,进行单因素方差分析和显著性检验。预先用HomogeneityofVariances进行方差齐性检验,如方差齐采纳LSD检验,如方差不齐采纳TamhaaeT2检验,P0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MTT法检测各试验组对COC1/DDP细胞增殖的影响

顺铂、血卟啉、顺铂和血卟啉联用对COC1/DDP细胞增殖的影响（见表1、2）,两种方法联用的增殖抑制率随着各自浓度的增加而增加,各组与对比组差异有统计学意义(P0.01)。表1顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的细胞增殖MTT试验OD值表2顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的增殖抑制率

2.2顺铂和血卟啉联合应用对COC1/DDP细胞凋亡的影响

顺铂组和血卟啉组的凋亡率高于空白对比组,其差异具有统计学意义(P0.05);血卟啉＋顺铂组与血卟啉组和顺铂组相比,其凋亡率高于血卟啉组和顺铂组,其差异均有显著性(P0.05)。提示血卟啉和顺铂都对COC1/DDP细胞有促进凋亡的作用,而且血卟啉和

顺铂联用能够加强这种促进作用(见表3、图1)。表3顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的凋亡率

2.3免疫细胞化学检测试验干预后COC1/DDP细胞内bcl2和bax表达的变化

bcl2免疫组化染色光学显微镜下观看到空白对比组和顺铂组中可见很多细胞内胞浆呈棕黄色,高倍镜下可见胞浆内有大量棕黄色颗粒,而血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组此种细胞明显削减。Bax蛋白的免疫组化染色可见在血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组中有较多的胞浆呈棕黄色颗粒的细胞,而对比组和顺铂中的此种细胞较少,bcl2蛋白及bax表达阳性率（见表4）。统计分析结果表明:血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组的bcl2蛋白阳性表达率显著降低(P0.05),而空白对比组和顺铂组的细胞内bcl2蛋白阳性表达率差异无显著性(P0.05)。bax蛋白阳性表达率在各组表达差异无统计学意义(P0.05)(见表4、图2)。表4顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的bcl2蛋白及bax表达阳性率

3争论

声动力疗法（SDT）是指对肿瘤患者静脉注射声敏剂,而后用肯定频率和强度超声辐射肿瘤部位,使聚集在肿瘤部位声敏剂产生抗肿瘤因子而杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤的生长。有学者认为由于超声发生空化作用,其结果是来源于声敏剂的自由基,再与氧分子反应生成过氧基和烷氧基,过氧基和烷氧基与溶液中的有机分子反应活性低,更易于到达靶细胞的表面,破坏癌细胞的脂质和细胞膜,导致膜通透性增加而损伤细胞,此外,过氧基和烷氧基还可以导致癌细胞内蛋白质变性,染色体变异等破坏细胞。目前认为较好的声敏剂仍是卟啉类为主［4］,因此本试验选择血卟啉做声敏剂能对超声有良好的敏感性,产生大量活性氧对细胞进行杀伤作用。

本试验发觉,CO

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C1／DDP细胞对顺铂明显耐药,血清峰值浓度(2.5g／ml)以下的顺铂对COC1／DDP细胞增殖未见明显影响,这与文献报道基本全都［5］。但与血卟啉合用时,血清峰值浓度以下的顺铂明显抑制了COC1／DDP细胞增殖。提示超声激活的血卟啉能够提高耐药的卵巢癌细胞COC1／DDP对顺铂的敏感性,从而增加顺铂对该细胞的杀伤作用。干扰细胞周期并诱导凋亡是顺铂治疗肿瘤的重要途径,而血清峰值浓度的顺铂对COC1／DDP的凋亡率几乎无影响,但与血卟啉合用时,可致细胞凋亡率明显上升，这提示超声激活的血卟啉提高耐药细胞株COC1／DDP对顺铂敏感性的机制可能是恢复了耐药细胞株的凋亡途径,从而恢复了顺铂治疗肿瘤的作用。

细胞凋亡是在基因掌握下的细胞自身消亡过程,涉及一系列的基因表达的级联反应,受凋亡抑制基因（bc12/bax）和凋亡促进基因的调控。顺铂可以诱导细胞凋亡,但耐药卵巢癌细胞中bc12/bax明显增高,这是导致细胞耐药的重要缘由之一。因此,抗肿瘤治疗中,有效地降低bc12/bax含量是取得疗效的关键之一。

已有讨论发觉,提高细胞内活性氧的水平,细胞凋亡的发生率明显增加,认为细胞内的ROS作为一种信使分子在调控细胞生存及凋亡过程中起关键作用［6,7］。1988年,Vaux等［8］首先证明bcl2基因高表达可明显延长细胞的生存周期。体外讨论亦表明bcl2可阻挡很多刺激物诱发的细胞凋亡,且bcl2的抑制可能是细胞凋亡的共同通道［9］。bax是bcl2家族的另一成员,与bcI2形成异二聚体,也对细胞凋亡进行调控［10］。在体内,bcl2与bax相互影响,相互拮抗,其作用并不直接表现为单独的bcl2和bax对凋亡的影响,而是由bcl2／bax来打算细胞是否发生凋亡。讨论显示，bc12／bax比值降低,可使肿瘤细胞发生凋亡,作为细胞调亡调控的主要因子bcl2蛋白家族,尤其是bcl2和bax的相互作用在调亡的调整中起关键作用。本试验的bcl2蛋白及bax蛋白免疫细化染色结果显示，超声激活的血卟啉联合顺铂作用人卵巢癌细胞株COC1/DDP，bcl2蛋白水平显著低于对比组(P0.05);而顺铂组和对比组比较,bcl2蛋白阳性表达率差异无统计学意义。说明超声激活的血卟啉联合顺铂作用可以降低人卵巢癌细胞株COC1/DDP的bcl2蛋白的表达水平,bax蛋白表达水平在试验组及对比组差异均无统计学意义,提示声动力作用是通过下凋bcl2蛋白的水平,使bcl2／bax的比值下降来促进人卵巢癌细胞株COC1/DDP发生凋亡。

声动力疗法（SDT）是继手术、放疗、化疗后新兴的一种肿瘤治疗手段,具有无创、细胞毒性低、选择性杀伤等优点。本试验仅初步讨论了超声激活的血卟啉联合顺铂对耐药的卵巢癌细胞的作用,还需要进一步增加超声的剂量,将血卟啉的浓度范围扩大,找出三者协同作用的最佳比例,为以后应用于临床供应理论基础。

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