肺结核痰检质量控制培训资料

肺结核痰检质量控制万建国各级各类试验室职责：县（区）级结核病试验室在省、地（市）参比试验室指导下，制订本县（市）结核病试验室检验工作计划。按照国家结核病试验室质量确保体系要求，做好本试验室开展检验项目标室内质控工作，负担同级间试验室（县级）第一复检者盲法复检工作，在所属地（市）级试验室组织下，开展痰涂片镜检盲法复检。按国家统一标准化操作程序常规开展痰涂片镜检工作，依照实际情况有能力、具备条件能够开展结核菌培养。接收上级试验室督导、现场评定和定时培训。对辖区内乡镇卫生院查痰点工作提供技术支持。乡镇查痰点乡镇查痰点在我国结核病防治工作中发挥着主要作用，它能够方便结核病可疑症状者就医，增加病人发觉。各地应依照实际情况设置乡镇查痰点。乡镇查痰点应该按卫生部要求开展工作，国家统一标准化操作程序开展痰涂片镜检工作，并按要求送痰涂片至县级进行复检；接收上级试验室培训、现场督导和技术指导。医疗机构试验室医疗机构结核病试验室在对应级别临床检验中心和上级结核病试验室技术指导下，开展质量有确保结核病试验室检验工作，严格按摄影关各项标准化、规范化操作程序进行试验室相关活动，并接收结核病试验室质量控制。涂片镜检试验室基本要求：试验室应有试验室分区（涂片染色区域和读片镜检区域），布局应该符合生物安全二级（BSL-2）要求；试验室应在靠近出口处设置洗手池；试验室墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂腐蚀，地面应防滑；试验操作台面应能防水，耐腐蚀、耐热；试验室中厨柜和试验台应牢靠，厨柜、试验台彼此之间应保持一定距离，方便于清洁；对于试验室中可开启窗户，应安装纱窗；试验室内应确保工作照明，防止无须要反光和强光；应有适当消毒设备；在试验室门口处应设挂衣装置，个人便装与试验室工作服分开放置；10、试验室应该装备开展痰涂片检验所需要仪器和设备。检验对象及要求：痰涂片检验（一）痰盒推荐使用螺旋盖、可密封、广口塑料盒搜集痰标本，参考规格：直径4厘米，高度2厘米。医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检验项目、痰标本序号1、2、3（1＝当日即时痰，2＝夜间痰，3＝次日晨痰），然后交给患者。（二）标本采集1、时间依照痰标本采集时间，可将标本分为三类：即时痰：就诊时深呼吸后咳出痰液；晨痰：患者晨起立刻用清水漱口后，咳出第2口、第3口痰液；夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出痰液；2、痰采集方法宣传教育对疑似肺结核病者，临床医护人员应经过解释，使其充分了解标本质量对对应检验项目标主要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰方法；如患者识字，可提供宣传教育材料。3、地点因为当患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有结核菌气溶胶，感染周围人群机率较高，故采集痰标本时应在远离人群开放空间进行，或在通风良好室内进行。患者留取痰标本，应由检验人员或经培训专员目视检验标本质量（尤其是用于首次诊疗痰标本）。合格痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出分泌物，标本量通常在3～5ml。干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发觉大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。因为这类标本是由肺部深处咳出，对肺结核诊疗最有价值，故AFB检出率较高。血痰：这类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰细胞特征外，含新鲜血液标本中可见到被染色血细胞。因为含血标本易干扰AFB镜检结果，故在制片时应尽可能防止挑取含血标本。粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅纤毛），伴有少许肺上皮脱落细胞（多数为圆形、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于1:3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞百分比较大且着色较深，核质比低于1:1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。这类标本AFB检出率较唾液高。唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少许口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比靠近或大于1:2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。因为这类标本进行AFB检验时检出率很低，用于对患者确定诊疗时是不合格标本。合格痰标本通常为干酪痰、褐色血痰或含少许新鲜血液血痰、粘液痰。痰标本不合格时，应深入指导并要求病人重新送检。进行细菌学检验时应在登记本和检验汇报单上注明标本性状，以供分析结果时参考。直接涂片检验检验对象依照检验目标分为两类：确定诊疗，发觉传染源；疗效评价，作为确定化疗方案和治疗效果评价指标。（1）确定诊疗：凡因结核病症状求诊及转诊可疑肺结核患者，均应进行痰涂片检验。确定诊疗涂片检验应采集3个合格痰标本。就诊当初在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。（2）疗效评价：凡已确诊、登记、治疗肺结核患者，在化疗期间按照要求应定时查痰：①初治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3个月和继续期结束时（通常为治疗后第2、5和6个月）；复治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3个月和继续期结束时（通常为治疗后第2、5和8个月）分别搜集一份晨痰和即时痰进行涂片检验。②初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在1个月时增加痰涂片检验一次；若复治涂阳患者治疗满3个月时痰菌仍阳性，应在治疗满5个月增加痰涂片检验一次。③确诊、登记涂阴肺结核患者，即使患者因故未接收治疗，也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检验（一）玻片制备1、用于抗酸菌（AFB）检验载玻片要求（1）一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。（2）每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检验。（3）应使用以95%乙醇擦拭（或浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕新载玻片制备涂片，在玻片反面一端1/3处注明试验室序号及标本序号（如使用载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。2、制备涂片（1）小心打开承载痰标本容器，预防产生气溶胶或使标本外溢。（2）仔细观察标本，使用折断竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1ml，于玻片正面右侧2/3处，均匀涂抹成10×20mm卵圆形痰膜。痰膜朝上静置自然干燥后（通常约需要30分钟）进行染色镜检。（3）涂抹完成后痰标本，在结果汇报前应暂时保留。（4）为了确保检验人员安全，禁止在涂抹痰标本同时，对载玻片进行加热。（二）染色1、萋尔－尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson），简称萋尼氏染色法（Z-N）（1）试剂配制：①石碳酸复红染色液：碱性复红储存液：碱性复红8g加95%酒精至100ml，充分振荡使复红溶解。5%石碳酸水溶液：40-50℃水浴加热石碳酸使之融解，取5g石碳酸复红工作液：10ml经定性滤纸过滤碱性复红储存液与90ml5%石碳酸水溶液充分振荡、混合均匀后，使用定性滤纸过滤。②5%盐酸乙醇脱色液：5ml浓盐酸（35%）与95ml95%乙醇混合。③亚甲兰复染液：储存液：0.3g亚甲兰溶于50ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。亚甲兰复染液：以蒸馏水3倍稀释0.3%亚甲兰储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲兰终浓度为0.1%。使用定性滤纸过滤，即得亚甲兰复染液。（2）染色步骤：①涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4次）。②滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应一直保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。③流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩下水。④自痰膜上端外缘滴加脱色剂充满痰膜，脱色3分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。⑤流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩下水。⑥滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。⑦流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩下水。待玻片干燥后镜检。⑧一张染色合格玻片，因为被亚甲兰染色而呈亮蓝色。将染色后玻片放置在报纸上，假如透过痰膜不能分辨报纸上文字，则表明该玻片涂抹过厚。2、荧光染色法AFB采取荧光染色法镜检，只限于那些每日工作量较大（日读片数超出25张）、具备荧光显微镜、且镜检人员阅读荧光染色玻片具备丰富经验试验室开展。（1）试剂配制：①染色剂（金胺O染液）：金胺O▲ 1 g石碳酸 50 ml乙醇 100 ml补蒸馏水至 1000 ml▲金胺O（auramineO，分子式为C17H21N3·HCl）：用于AFB染色时必须使用最低染料含量约80％生物染色剂。②脱色剂：3%盐酸乙醇（配制方法参考萋尼氏染色）。③复染剂：0.5%高锰酸钾水溶液。（2）染色步骤：①玻片经火焰固定后,滴加染色剂盖满玻片，染色30分钟；流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩下水。②自痰膜上端外缘滴加脱色剂，充满痰膜，脱色3分钟或至无色,流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。③滴加复染剂复染2分钟，沥去复染液，自然干燥，准备镜检。（三）镜检1、萋尼氏染色玻片镜检使用10×目镜双目显微镜读片。取染色完成且已干燥玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调整至适当亮度，调整焦距至可见细胞形态；移开40×物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100×油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其它细菌和细胞呈蓝色。为预防AFB交叉污染，禁止油镜镜头直接接触玻片上痰膜。因为香柏油（cedarwoodimmersionoil）能够溶解复红染料，使萋尼氏染色退色，而且轻易干燥凝结，对油镜头造成损害；故推荐使用专门用于100×油镜、不干燥、不变硬镜油（immersionoil）。读片时，首先应从左向右观察相邻视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依这类推。通常20mm痰膜，使用100×油镜，每行可观察约100个视野。仔细观察完300个视野，通常需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员玻片阅读量不要超出25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。2、荧光染色玻片镜检玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后，首先以10×目镜、20×物镜进行镜检，发觉疑为AFB杆状荧光颗粒时，使用40×物镜确认。在暗背景下，抗酸菌发出杆状荧光。对应波长光线激发染料产生可视光能力，伴随时间而衰减。故荧光染色后涂片应于当日镜检；假如玻片数量过多，应将涂片放置于4℃（四）结果汇报1、萋尼氏染色镜检结果分级汇报标准抗酸杆菌阴性（－）：连续观察300个不一样视野，未发觉抗酸杆菌。汇报抗酸杆菌菌数：1～2条抗酸杆菌/300视野。抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条抗酸杆菌/100视野。抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野。抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野。2、荧光染色镜检结果分级汇报标准荧光染色抗酸杆菌阴性（-）：0条/50视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（汇报抗酸菌数）：1～3条/50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：