核医学受体的放射性配基结合分析演示文稿

核医学受体的放射性配基结合分析演示文稿当前第1页\共有62页\编于星期三\6点（优选）核医学受体的放射性配基结合分析当前第2页\共有62页\编于星期三\6点一、受体功能识别特异的信号物质--配基，识别的表现在于两者的特异结合。把识别和接受的信号准确无误的放大并传递到细胞内部，同时启动一系列胞内生化反应，最后导致特定的细胞反应，使得胞外信号转换为胞内信号。当前第3页\共有62页\编于星期三\6点受体接受细胞外的特定信号(神经递质、激素、某些药物和毒物等，称为配基，ligand)，通过受体后特定的信号传递系统，引起细胞特定的生物效应，因此是高等动物适应环境、协调整体各种细胞功能的关键性分子。受体及其信号传递系统参与了体内多种生理、病理过程，例如肿瘤的生成、免疫应答、补体激活等。当前第4页\共有62页\编于星期三\6点根据在细胞中的定位，把所有的受体分为:膜受体核受体

二、受体的分类:当前第5页\共有62页\编于星期三\6点1、膜受体：膜受体的分子一般由几条到几十条氨基酸链组成胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分。配基从细胞的外侧与受体的胞外部分或跨膜部分上特定的结合位点结合，使受体分子发生构型变化，通过膜内部分将信息传给相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。

当前第6页\共有62页\编于星期三\6点根据膜受体的跨膜结构又可以分为：单链跨膜受体：包括酪氨酸激酶型受体，如各种生长因子受体；非激酶型受体，如细胞因子受体。G蛋白偶联受体：受体的氨基酸链7次跨越细胞膜，在人体内分布很广泛。离子通道型受体：受体的几个组成亚单位竖插入膜，中央形成空隙即为离子通道，如N-胆碱能受体、甘氨酸受体等。当前第7页\共有62页\编于星期三\6点当前第8页\共有62页\编于星期三\6点当前第9页\共有62页\编于星期三\6点2、核受体：为一条氨基酸链，可分为四个功能区：A/B区:在不同受体中差异最大，主要功能是选择和激活基因转录。C区:与染色体DNA结合的区域，上面有一定的氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序列(称作反应原件,responseelement)相结合。D区:主要作用是受体在核内的定位。E区:与配基结合的区，并有转录激活作用。

当前第10页\共有62页\编于星期三\6点受体的亚型受体亚型：在分子结构上既有相似之处，又存在一定的差别，对一定的配基具有不同的亲和力，在生物学上具有不同的效应。在药理实验等研究中发现，许多受体存在着两种或两种以上的亚型。只有内源性配基相同而氨基酸序列同源性很高的受体才可列为同一型的不同亚型。例如表皮生长因子受体家族就包括表皮生长因子、HER2、HER3、HER4等四个成员。当前第11页\共有62页\编于星期三\6点受体数量：占细胞蛋白总量十万之一到百万分之一（一个细胞上仅有数千个受体分子），一般方法难以分离和测定受体分子。

当前第12页\共有62页\编于星期三\6点配体：是指能和受体结合并引起相关效应的化合物。除了与受体结合外本身并无其他功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是通知细胞在环境中存在一种特殊信号或刺激因素。当前第13页\共有62页\编于星期三\6点

三、受体与配体的结合

配体与受体的结合是一种分子识别过程，它靠氢键、离子键与范德华力的作用，随着两种分子空间结构互补程度增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用力就会大大增加，因此分子空间结构的互补性是特异结合的主要因素。

同一配体可能有两种或两种以上的不同受体，例如乙酰胆碱有烟碱型和毒蕈型两种受体。同一配体与不同类型受体结合会产生不同的细胞反应，如Ach可以使骨骼肌兴奋，但对心肌则是抑制的。

配体可以是神经递质、激素、某些药物等。当前第14页\共有62页\编于星期三\6点四、受体与配基结合的特性

1、可饱和性(saturability)：每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上的配基将渐趋饱和。当前第15页\共有62页\编于星期三\6点2、可逆性：如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余的放射配基移去(例如淋洗或透析)，则放射配基与受体的复合物会逐步解离，亦即这种结合是可逆反应。如果向反应系统中加入大量非标记配基，使其浓度远高于放射配基，则将取代大部分原已结合的放射配基，使放射性复合物减少,也说明配基与受体的结合是可逆的。

解离后的配基是原形，不起代谢变化。

当前第16页\共有62页\编于星期三\6点3、特异性和亲和性：受体的特异性：受体具有特异识别配基的性能，因此只有严格构型和构象的配基分子才能选择性地与受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织（靶器官）的专一性上，如雌激素对子宫等器官有兴奋作用，这是因为这些器官上雌激素受体的数量明显高于其它器官。受体的亲和性是指受体和配基的结合能力，受体亲和性高就说明受体和配基结合牢固，不容易解离。当前第17页\共有62页\编于星期三\6点4、与效应的一致性：受体的主要功能是介导配体的生物效应，如果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定的生物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。配体与受体结合后，引起阳性生理效应，称为激动剂。配体与受体结合后，阻断内源性配基的阳性生理作用，称为拮抗剂或阻断剂。

当前第18页\共有62页\编于星期三\6点五、受体的生理调节正常生理状态下的受体处在一个不断合成与降解的动态平衡中，但其数量和亲和性也会因疾病、药物作用而发生变化。1、向下调节(down-regulation)

细胞所处环境中某种激动剂浓度增高或长期作用，结果使其相应受体的数量减少，并出现受体对此物质的敏感性下降或耐受性增高等现象。如哮喘病人长期服用β-激动剂产生耐受性增高，即药效减弱。当前第19页\共有62页\编于星期三\6点2、向上调节(up-regulation)细胞所处环境中某种拮抗剂的浓度过高或长期作用，结果会使受体数量增高，出现受体敏感性增高，表现为增敏或撤药后反跳现象。如高血压病人长期服用心得安，若突然停药，可出现血压升高的反跳现象。由于受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研究病理变化和评价药效的重要内容。

当前第20页\共有62页\编于星期三\6点六、受体与疾病遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病的常见原因1、基因突变致使受体异常，引发功能障碍，绝大多数是功能降低或完全丧失，有家族史，病情严重。如睾酮受体基因突变致该受体缺陷引起睾丸完全雌性化病。2、机体对受体产生自身抗体，激动（如Graves综合症患者产生TSH受体抗体，直接持续激动甲状腺TSH受体）或阻断（如重症肌无力患者产生N-Ach受体抗体，占领但不激动受体）受体。3、某些病有受体异常，非原始发病环节，为发病重要环节，采取针对措施可控制病情。甲亢用β肾上腺素阻断剂，哮喘用β肾上腺素激动剂。4、受体与肿瘤：某些受体基因可突变成为癌基因，引发肿瘤；激素受体在肿瘤中存在与否决定治疗方案（乳腺癌，白血病）。当前第21页\共有62页\编于星期三\6点§2.受体-配基结合反应的基本原理

RBA(radioligandbindingassay)的基本原理与IRMA基本相同，应用放射性标记配体，在一定条件下与受体（R）结合成配体与受体复合物（R－*L），分离并测定R－*L的放射性，然后经数据处理，对受体的性质进行定性和定量的分析。当前第22页\共有62页\编于星期三\6点定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。

当前第23页\共有62页\编于星期三\6点RBA的优点：高灵敏度：高比活度的配基和高亲和力的受体反应必然会产生高灵敏度的分析技术。RBA的灵敏度可以达到10-15mol/l；特异性强：受体和配基的结合特异性和专一性保证了方法的特异性;受体制剂的多样性：同一组织或细胞上有多种受体，因此某种组织或细胞制剂可以用多种配基做受体分析；动物受体和人的受体存在相容性，在动物上获得的知识，多数可以用于人类。当前第24页\共有62页\编于星期三\6点(一)简单单点系统受体与配基相互结合的基本规律简单单位点系统：对某种受体而言，其所有的受体具有完全相同的结合特异性和生理效应，且所有受体都只有一个结合位点，以1：1的关系与配基结合，不表现明显的正负协同效应。有时，一个受体系统中存在两(多)种亚型，但结合的配基无选择性，尽管亚型的生物效应可能不全相同，结合反应却表现出完全相同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。当前第25页\共有62页\编于星期三\6点将上式展开重排，得到当前第26页\共有62页\编于星期三\6点可以看出，[RL](复合物浓度)和[LT](配基总浓度)并非线性关系，而是曲线关系。对一定数量([RT](受体总浓度)固定)和一定亲和力(KD固定)的受体来说，配基浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大多数受体都变为复合物，也就是受体被饱和了。这就是饱和曲线。

当前第27页\共有62页\编于星期三\6点曲线的高度主要反映受体的数量多少，受体越多，曲线高度越高；曲线上升的快慢取决于配基与受体的亲和力，所以，KD越小(亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大(亲和力越小)，饱和曲线上升越慢。当前第28页\共有62页\编于星期三\6点(二)Scatchard作图：将改写成在绘制饱和曲线时，以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物和游离配基的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标，则对简单单位点系统来说，将得到一条逐渐下降的直线。当前第29页\共有62页\编于星期三\6点Scatchard作图目前，Scatchard作图主要用于定性，即判断是否简单单位点，还是有其它复杂情况。例如同一系统中同一种受体有两种以上亲和力的亚型，或者受体有正协同或负协同作用(Scatchard作图呈曲线)当前第30页\共有62页\编于星期三\6点（三）正负协同作用

当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲和力逐步下降，称之为负协同作用如曲线(2)，亲和力逐步增大，称之为正协同作用如曲线(3)。

负协同正协同当前第31页\共有62页\编于星期三\6点（四）非特异结合（non-specificbinding，NSB）

上述饱和曲线是受体与配基的特异结合形成的。这种结合的特点是低容量和高亲和力，所以容易饱和。但是，任何受体标本除特异结合外，还会有一部分非特异结合，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分非特异结合的放射性混在一起，测到的是总放射性(totalbinding,TB)，必需先减去非特异结合(NSB)，才能得到特异结合(specificbinding,SB)的放射性。

当前第32页\共有62页\编于星期三\6点NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱和，也就是随着配基浓度的升高，它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线。当前第33页\共有62页\编于星期三\6点（五）受体与配基反应的动力学（kinetics）

受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快，这种快速结合和快速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。大量非标记配基当前第34页\共有62页\编于星期三\6点（六）竞争性取代反应

在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体的结合位点结合，则会与放射配基竞争与受体结合，最终将表现为放射配基与受体形成复合物的能力降低，但受体数量不变,所以叫竞争性取代反应。此时，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂,它们和受体结合后不改变受体分子的结构。当前第35页\共有62页\编于星期三\6点表示竞争剂抑制作用强弱的指标：IC50值和KI。IC50值：指抑制50％受体与放射配基结合所需竞争剂的浓度，IC50值大，表明竞争剂抑制作用小。KI：竞争剂的平衡解离常数，KI越小，表明竞争剂抑制作用越大。

当前第36页\共有62页\编于星期三\6点二、双（多）位点系统一种配基可以和两种以上的受体亚型结合，每种亚型都有相应的KD值（自学）。当前第37页\共有62页\编于星期三\6点§3.受体放射分析的基本方法

RBA的方法学：一般RBA分析都是以求得样品中的受体数量[RT]为目的。用定量的受体制剂与大量的标记配基反应，使受体得以饱和。分离受体-标记配基复合物，测量其放射性。根据复合物的放射性计算受体的结合容量或结合位点数。当前第38页\共有62页\编于星期三\6点

离体RBA基本方法的流程为：

当前第39页\共有62页\编于星期三\6点一、受体标本的制备

在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。

（一）组织切片冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5-50μm。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（用放射自显影法或免疫组化）。

当前第40页\共有62页\编于星期三\6点（二）游离的完整细胞悬液完整的活细胞可以是血细胞，培养的单层细胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等。使用完整细胞的优点：1、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱，膜内pH、离子梯度也保存着。受体与其相连的效应系统（如G蛋白）也保存完好。2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。当前第41页\共有62页\编于星期三\6点注意点：完整细胞的受体分析必须尽可能选用不易穿透细胞膜双层磷脂的标记物，否则由于游离配基进入细胞内可引起较大误差。此外，还必须注意防止操作过程中可能导致细胞表面生理活性的改变。如，完整细胞的膜受体在37℃时会发生受体入内化现象，这会破坏结合反应的平衡状态，导致测定的KD值不正确，如80%EGF受体入内化，而在4℃则可阻止入内化。当前第42页\共有62页\编于星期三\6点（三）亚细胞组分

大多数受体的RBA需经差速离心法分成胞膜、胞浆、胞核，取所需组分进行分析。其优点是：除去大部分杂蛋白和内源性配基，减少NSB或其它干扰因素；受体蛋白得到初步浓缩，使富集的受体制剂获得可靠的分析结果。当前第43页\共有62页\编于星期三\6点亚细胞组分的分离一般都采用差速离心法。一般先制成匀浆，再在含0.25～0.3mol/L蔗糖缓冲液中先后以不同离心力进行离心，分离不同的亚细胞组分。当前第44页\共有62页\编于星期三\6点实验过程应注意：全部过程在4℃下进行操作，以保证受体标本的结合活性；制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它物质（如EDTA，Mg2＋）应严格控制。为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。

当前第45页\共有62页\编于星期三\6点二、放射性配基的选择

制备优良的放射性配基是受体结合试验的首要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：①配基的特性；②实验目的。

当前第46页\共有62页\编于星期三\6点（一）对放射性配基的基本要求1、高比活度：组织细胞内的受体浓度一般都很低，约104-105个/细胞，或0.01-1.0pmol/mg蛋白的水平，低比活度的配基难于达到分析灵敏度的要求。一般要求比活度在3.7×1011Bq/mmol以上。2、高亲和力:可以减少标记配基用量放射性配基与受体的结合物解离较慢，有利于结合和游离配基的分离。当前第47页\共有62页\编于星期三\6点3、高特异性:即该配基与所研究受体有选择性结合，理想的是该配基只与一种受体或受体亚型结合。但没有一种配基是完全选择性的，所以要结合实验研究的目的，选择对某一受体或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。4、高的稳定性及放化纯度:包括标记的稳定性、贮藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性。具有95%以上的放化纯度。

总的来说,配基的选择要根据实验目来定。当前第48页\共有62页\编于星期三\6点目前，用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I标记。3H标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条件，仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。当前第49页\共有62页\编于星期三\6点（二）放射性配基的质量鉴定1、放射化学纯度:

除新鲜产品外,存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在95％以上。2、结合活性鉴定

3、比活度：受体结合分析的结果计算离不开准确的比活度数据。当前第50页\共有62页\编于星期三\6点三、受体放射分析的类型

（一）标记配基饱和法1、单点饱和法：定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体-配基复合物的放射性计算受体结合容量（或结合位点数）。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出KD，误差也相对大些。

当前第51页\共有62页\编于星期三\6点2、多点饱和法：一定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量（一般7-8个实验点），使受体的结合趋于饱和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力（RT、KD），结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大，工作量大。

当前第52页\共有62页\编于星期三\6点（二）非标记配基饱和法

一定量的受体和标记配基，逐渐增加非标记配基（一般7－8个实验点），使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。

这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。

当前第53页\共有62页\编于星期三\6点四、分析条件的选择（一）标记配基浓度

试验类型不同，选用的标记配基浓度也有不同。单点饱和试验要求饱和量的标记配基。对于多点饱和试验，应尽可能覆盖饱和区及非饱和区，还应考虑最低一点有足够的放射性满足放射性测量统计上的要求，最高一点的浓度则往往要考虑配基的来源及价格。

（二）受体浓度一般说在一定范围内受体结合位点随组织量的增加而增加，特异性结合量与组织浓度成线性关系。在线性范围内，较高受体浓度，有时可增加特异性结合与非特异性结合的比值，有人提出，受体浓度应选为约相当于KD值。在实践中，往往需要通过实验来确定受体浓度。

当前第54页\共有62页\编于星期三\6点（三）温育温度与时间温度是影响反应速率的重要因素。温度高，结合快，达到反应平衡时间短，温度低，反应终止时容易降温，减少分离过程中复合物的解离。另外，温度低对配基及受体的稳定性有利。不同受体结合系统的最佳温度和时间要经过试验选定。对于饱和或竞争取代试验，应要求反应达到平衡，故温育时间应足够长以达到平衡状态。温育温度与平衡时间是紧密相关的，不同的受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、温育温度、配基及受体浓度的不同而不同。一般室温（22℃）操作比较方便。0℃温育平衡时间虽然长一些，但其结果之重复性更好。

当前第55页\共有62页\编于星期三\6点（四）缓冲液结合分析使用过多种缓冲液，如磷酸盐缓冲液，Tris-HCI缓冲液等，所选缓冲液应不干扰结合，并在较大范围内可稳定pH。一般说，结合分析的pH应处于生理范围，即pH=7-8。

钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同的影响。因此要根据具体目的决定选用与否。如果加入的受体蛋白量较少时，宜在缓冲液加入适量蛋白，使反应液内蛋白浓度为0.1mg-1mg/ml为好。为了阻止肽类的降解，常在分析时加入各种肽酶抑制剂。但要视具体是哪种肽而定，以确保实际有效。因为有些蛋白酶抑制剂有抑制特异性结合的作用。当前第56页\共有62页\编于星期三\6点五、结合体与游离配基的分离

受体-配基结合分析主要是测定反应平衡时结合配基的量，求解受体的密度与平衡解离常数。反应一般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。

理论上，一经分离，反应的平衡就会被破坏，所以选择适当的分离方法和环境，使受体-配基复合物在分离过程中的解离减少到最低限度。低温是降低解离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。常用的分离方法有离心法、滤膜法、吸附法、透析法、电泳法等。若复合物解离快，则只能选择快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温度等方面保持各样品管之间的一致性，以减少误差。当前第57页\共有62页\编于星期三\6点

（一）抽滤法（滤膜法）

1、选用的滤膜材料：既能阻挡复合物又不要过多产生对游离标记配基的非特异性吸附。常用的滤膜是玻璃纤维滤膜。

2、影响因素（1）复合物的解离：一般说，低温时解离较慢，故滤膜及缓冲液应保存于低温。用冰冷缓冲液抽洗为好。（2）负压：若为多头抽滤器，应注意各孔压力的均一性（3）标记配基对滤膜的吸附：标记配基吸附于滤膜是抽滤法非特异性结合的主要来源之一。也是抽滤法的主要缺点，减少标记配基吸附于滤膜的方法有：①滤膜预先用非标记配基浸泡；②如果是多肽或蛋白标记配基，用

1％白蛋白浸泡；③用一定量的淋洗液