基因组序列注释

第五章基因组序列注释当前第1页\共有93页\编于星期三\2点基因组测序相关技术发展

198119861989199119941998200020022003200620072008Inthecomingfuture200920102005AffylaunchesGeneExpressionmicroarraysRiseofGenbankdatabasesfromDNAsequencingABIcommercializesfirstautomatedDNAsequencerLowhangingfruit:cysticfibrosismutationidentified3700DNAAnalyzerinHumanGenomeProject;DNAsequencinggoesindustrialFirstmicroarraypublication-onArabidopsisILMNlaunchesgeneexpressionarraysHumanGenomeProject&CeleraGenomicscompletesfirstdraftgenomeHapmapprojectlaunchedHapmap1stphasedatareleaseAffy&ILMNbothlaunched100KgenotypingarraysRiseofGenomeWideAssociationStudies(GWAS)RocheGSFLXlaunchedILMNboughtSolexa;launchesGAABISOLiD1.0Launched!TheSequencingShakeup!!SOLiD3.0:100GBoutofthebox!The3rdGenerationSequencingwillbelaunchedILMNHiSeq2000launched当前第2页\共有93页\编于星期三\2点<2weeks~$1,0000.010.101.0010.00100.001,000.0010,000.00100,000.00$MThroughput

(Gb)CostofperHumanGenomeInnovationofNGSthroughput3Gb6Gb20-30Gb0204060801001202402007200820092010199020012012200720100.001Moore’sLaw更低的价格使得基于测序的科研和临床应用越来越被接受13years~$3,000,000,000200Gb-300Gb测序技术的发展带来测序价格的下降当前第3页\共有93页\编于星期三\2点Illumina/Solexa/GIIxGeneticAnalyzer50~95GB/runIllumina/Solexa/HiSeq200GB/runRoche/454GenomeSequencerFLX500Mb/runAppliedBiosystemsSOLiD4100GB/runAppliedBiosystemsSOLiD/HQ300GB/run成熟的二代测序技术平台当前第4页\共有93页\编于星期三\2点高通量测序服务未知基因组测序(Denovogenomesequencing)基因组重测序(Wholegenomeresequencing)实验数据分析MatePair测序构建Scaffold30X的覆盖率

(454&(SolexaorSOLiD))序列预处理（质量控制）基因组拼接（基于reference拼接）注释(基因功能、代谢通路、比较基因组)SNP发现及注释实验数据分析30X以上的覆盖率

(SolexaorSOLiD)序列预处理（质量控制）基因组分型技术SNP、Indel、CNV、染色体结构变异及注释与表型相关的全基因组关联分析和功能连锁性分析当前第5页\共有93页\编于星期三\2点高通量测序服务外显子捕获测序(Targetexomecapture)全基因组甲基化测序(DNAmethylationsequencing)实验数据分析>30X的覆盖率

(SolexaorSOLiD)序列预处理（质量控制）基因组分型技术SNP、Indel、CNV、染色体结构变异及注释与表型相关的全基因组关联分析和功能连锁性分析实验数据分析30X以上的覆盖率(SolexaorSOLiD)序列预处理（质量控制）甲基化位点检测及注释当前第6页\共有93页\编于星期三\2点高通量测序服务转录组测序(RNA-seqsequencing)microRNA测序(microRNAsequencing)实验数据分析mRNA打断、反转录、加接头Denovo454构建转录图谱Referencebarcode建库Solexa，SOLiD序列预处理（质量控制）表达丰度统计注释(功能、代谢通路、表达差异比较)未知转录本的分析实验数据分析microRNA提取、两头加接头、反转录、建库(SolexaorSOLiD)序列预处理（质量控制）已知microRNA丰度统计未知microRNA预测及丰度统计当前第7页\共有93页\编于星期三\2点高通量测序服务元基因组测序(meta-genomesequencing)未知病毒检测(Unknownvirusdetecting)实验数据分析DNA提取、建库序列预处理（质量控制）拼接、注释(功能、代谢通路)丰度统计、比较元基因组实验数据分析低量RNA、DNA处理、建库与宿主、微生物、病毒数据库比较未知病毒的发现及预测当前第8页\共有93页\编于星期三\2点学习重点：1)基因注释的方法2)基因功能的研究方法当前第9页\共有93页\编于星期三\2点基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组作为一个整体如何行使其功能？用什么方法寻找基因？用什么方法研究基因的功能?计算机分析+实验当前第10页\共有93页\编于星期三\2点真核生物基因组的注释蛋白质编码基因的注释RNA基因的注释重复序列的注释假基因的注释当前第11页\共有93页\编于星期三\2点基因组注释SequenceGENESCANORFFinderGENEMARKGenePrediction…BlastnFastaHomologySearchTranscriptionRegulatoryRegionDomainIdentify(HMMER,BLIMPS)Transmembrane(TMAP,TMHMM)LocalizationSites(Psort)Physical&ChemicalPara(PI/MW,EXTCOEF)Post-translationalmodifications(NetNGlyc…)ProteinAnnotation…GeneOntologyPathwayPredictedGeneOrGene当前第12页\共有93页\编于星期三\2点当前第13页\共有93页\编于星期三\2点3.1寻找基因基因组序列查找基因。有两种常见的方法：计算机分析寻找与基因有关的序列。通过对DNA序列进行实验分析，看其能否表达基因产物。

当前第14页\共有93页\编于星期三\2点3.1.1根据基因结构特征搜寻基因基因不是核苷酸的随机排列而是具有明显特征：基因的编码区是可读框。可能的六种ORF当前第15页\共有93页\编于星期三\2点1.根据开放读码框预测基因a.起始密码子ATG：第一个ATG的确定则依据Kozak规则：Kozak规则是基于已知数据的统计结果，所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。当前第16页\共有93页\编于星期三\2点若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。当前第17页\共有93页\编于星期三\2点b.终止密码子

终止密码子:TAA,TAG,TGAGC%=50%终止密码子每64bp出现一次；GC%>50%终止密码子每100－200bp出现一次；由于多数基因ORF均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是ORF不少于100个密码子。当前第18页\共有93页\编于星期三\2点细菌基因组的ORF阅读相对比较简单，错误的概率较少，但单纯的ORF扫描对高等真核生物DNA效果不佳。内含子使ORF扫描复杂化当前第19页\共有93页\编于星期三\2点内含子的出现给计算机判读基因带来不少问题，对ORF扫描的基本程序的编写要考虑以下几个问题：1）密码子偏倚；2）外显子—内含子边界；3）上游调控序列。当前第20页\共有93页\编于星期三\2点1）密码子偏爱性编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA，GCC或GCT，而GCG很少使用。特定种属有特征性的密码子偏爱，这些序列在编码区常常出现，非编码区只保持平均的碱基分布水平。当前第21页\共有93页\编于星期三\2点上游外显子-内含子边界的共有序列在真正基因中发现的真实序列之间的关系。2）外显子－内含子边界外显子和内含子的边界有一些明显的特征如：内含子的5‘端或称供体位（donorsite）常见的顺序为5’-AG↓GTTAAGT-3’；3’端又称受体位（acceptorsite),多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；当前第22页\共有93页\编于星期三\2点当前第23页\共有93页\编于星期三\2点3）上游控制顺序几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。大多数CpG岛都位于管家基因和大部分组织专一性表达基因的5’侧翼区以及基因的第一个外显子区。

当前第24页\共有93页\编于星期三\2点

3.1.2同源基因查询通过已存入数据库中的基因序列与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基序列及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。当前第25页\共有93页\编于星期三\2点同源有如下几种情况：A.DNA序列某些片段完全相同；B.开放读码框排列类似，如有等长外显子；C.开放读码框翻译成的氨基酸序列的相同；D.模拟多肽高级结构相似。当前第26页\共有93页\编于星期三\2点当在氨基酸水平进行比较时，两个序列之间缺少同源性就更明显。当前第27页\共有93页\编于星期三\2点

同源性,一致性和相似性1）同源性(homology)基因系指起源于同一祖先但序列已经发生变异的基因成员。分布在不同物种间的同源基因又称直向同源基因。同一物种的同源基因则称共生同源基因（水平基因）,水平基因由重复后趋异产生。基因同源性只有“是”和“非”的区别,无所谓百分比.当前第28页\共有93页\编于星期三\2点2)一致性(identity)：指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基成员,或者蛋白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成员,可用百分比表示.3)相似性(similarity)：指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。可取代氨基酸系指具有相同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成员,它们之间的代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能。当前第29页\共有93页\编于星期三\2点相似性与一致性249MFN-MAIPFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG232ILTSLTLPFSAGAYAQALNQQQTTV

IS--TS

GS注:红色为一致性氨基酸,蓝色为可取代氨基酸,白色为趋异氨基酸.一致性氨基酸百分比为红色氨基酸所占的比例,相似性氨基酸百分比为红色和蓝色氨基酸相加所占的比例.当前第30页\共有93页\编于星期三\2点基因注释软件1)目前基因注释程序的编写主要依据两种信息内涵:

1.signalterms(信号指令),如起始密码,终止密码,终止信号,剪接受体位与供体位序列,多聚嘧啶顺序,分支点等保守的顺序组成;2.contentterms(内容指令),如密码子使用偏好.对结构紧凑的小基因组上述注释软件效果不错,但对大基因组特别是超长基因的注释有很大困难.在一个长度数十或数百kb的内含子中,存在许多可能误判的信号指令.2)常用的注释软件如GenScan主要偏重于内容指令,而FgeneSH则着重于信号指令.由于每种生物都有种属专一性的密码子偏好,也存在某些非保守的信号指令,因此在超长基因注释中常出现正向错误(false-positive,多注释)或负向错误(false-negetive,少注释).

引自:Naturereviewsgenetics,4:741-749,2003.当前第31页\共有93页\编于星期三\2点不同注释软件之间的效率Performanceofthreepopulargenepredictionprogramson42semiartificialgenomicsequencescontaining178knownhumangenesequences(900exons).Sensitivityispercentageofexonsthatarepredictedcorrectly.Selectivityispercentageofpredictedexonsthatarecorrect.ReproducedwithchangesfromYadaetal.,2002ColdSpringHarborGenomeSequencingandBiologyMeeting,May7-11,2002.FGENESHisbyfarthemostaccurateofthreeprograms.效率与准确率比较------------------------------------------------------------------------------------------programsensitivityspecificitymissedexon(%)wrongexon(%)------------------------------------------------------------------------------------------FGENESH77.165.79.623.2GenScan66.544.912.040.9HMMGene69.536.615.555.5------------------------------------------------------------------------------------------

当前第32页\共有93页\编于星期三\2点人类基因注释标准Knowngene:与人类已知cDNA和蛋白质顺序同源的基因.Novelgene:与脊椎动物cDNA或其它物种蛋白质同源的基因.Noveltranscripts:与novel基因相似,但缺少明确的ORF.Putativegene:有同源EST支持,但缺少cDNA或ORF.Predictedgene:数据库中至少有一个外显子支持,但缺少cDNA或明确的ORF.Pseudogene(假基因):与已知蛋白质有50%的同源性,但cDNA残缺,在其它位点存在正常的同源基因的顺序.引自:Nature414:865-871,2001(人类22号染色体注释)当前第33页\共有93页\编于星期三\2点人类基因总数可能是永远解不开的迷?1.人类基因总数的预测有三种方法:cDNA和ESTs顺序,计算机注释,比较基因组学(保守的ORF).2.已报道的人类基因总数的版本:1)Celara:27894HGR:29304(Esemble)(2000)

Celara与HGR的注释基因有7000个不同,相同的为20000左右,加上不同的注释约34000个.2)Esemble注释:24847(2003年)EnsemblisajointprojectbetweenEMBL-EBIandtheSangerInstitutetodevelopasoftwaresystemwhichproducesandmaintainsautomaticannotationoneukaryoticgenomes.3)EBI:27462(2003,nature423:576)4)Genscan:

65452

许多人倾向于不可能知道人类基因组精确的基因数.当前第34页\共有93页\编于星期三\2点几种模式生物注释的基因总数大肠杆菌(E.coli):4800酵母(yeast):6200线虫(nematode):19000果蝇(fly):13600拟南芥(Arabidopsis):25000水稻(rice):60000玉米(maize):59000老鼠(mouse):30000当前第35页\共有93页\编于星期三\2点功能域注释1)任何基因编码的蛋白质都由一些在高级结构水平具有特征性的功能域组成,如引导肽,受体区,激酶区,DNA或RNA结合域等。2)功能域具有很强的保守性,关键的氨基酸组成及其排列位置是相当衡定的,是鉴定功能域的主要标识。3)功能域是目前确定基因功能的主要依据之一.4)已由许多专门的功能域注释软件,可用于基因组序列的注释。当前第36页\共有93页\编于星期三\2点什么是功能域(domain)?定义:1)Regionofaproteinwithadistincttertiarystructure(e.g,globularorrodlike)andcharacterristicactivity;homolgousdomainsmayoccurindifferentprotein.(引自“MolecularCellBiology”)2)Acontinuouspartoftheaminoacidsequenceofaproteinthatcanbeequatedwithaparticularfuction.(引自“GeneVII”)3)Portionofaproteinthathasatertiarystructureofitsown.Inlargerproteinseachdomainisconnectedtootherdomainbyshortflexibleregionsofpolypeptide.(引自“MolecularBiologyofTheCell”)当前第37页\共有93页\编于星期三\2点同源功能域注释当前第38页\共有93页\编于星期三\2点3.1.3实验确认基因1.Northern杂交确定DNA片段是表达序列：Northern杂交当前第39页\共有93页\编于星期三\2点注意事项：a.当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；b.考虑组织专一性和发育阶段的问题；c.基因表达产物丰度的问题如果丰度较低，用拟Northern杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析。

当前第40页\共有93页\编于星期三\2点拟Northern杂交——

根据已知的DNA序列设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。

动物园杂交——

根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的DNA序列与来自另一亲缘物种的DNA片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有1个或多个基因，这种方法又称为动物园杂交。当前第41页\共有93页\编于星期三\2点动物园杂交（Zooblotting)当前第42页\共有93页\编于星期三\2点2.由EST或cDNA指认基因目前在数据库中已经测序的物种的EST和cDNA序列的数量正在呈指数增长。EST和cDNA是基因转录加工后的产物，可以确切无疑的代表相应基因成员的存在。

寻找目的序列的EST证据当前第43页\共有93页\编于星期三\2点cDNA：CDS：ORF：EST：当前第44页\共有93页\编于星期三\2点3.获取基因全长cDNA序列A.构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库。B.根据已知片段设计引物，RACE技术得到基因的全长cDNA序列。

当前第45页\共有93页\编于星期三\2点4.确定DNA顺序中基因的位置A.通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域；B.通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；当前第46页\共有93页\编于星期三\2点3.2基因功能预测确认DNA序列中的基因序列后，下一个问题就是探索它的功能，这是基因组研究的重点所在，也是一个难点。信息分析+实验生物学当前第47页\共有93页\编于星期三\2点影响途径？影响器官？基因类型？底物？细胞内分布？空间结构？基因功能的含义当前第48页\共有93页\编于星期三\2点基因水平转录水平蛋白水平当前第49页\共有93页\编于星期三\2点基因功能研究方法：生物信息学方法当前第50页\共有93页\编于星期三\2点当前第51页\共有93页\编于星期三\2点当前第52页\共有93页\编于星期三\2点3.2.1计算机预测基因功能原理：主要依据同源性比较，同源性反应出进化关系。方法：既存数据库的比较分析。

分析的基础是:如果一个新测序的基因与另一个原来已测序的基因相似，那么就揭示他们可能有进化上的关系，并且新基因的功能很可能与已知基因的功能相同，或至少是相似。当前第53页\共有93页\编于星期三\2点3.2.2蛋白质结构域在功能预测中的意义同一物种或不同物种中具有相同结构域的蛋白质可将其划归在同一蛋白质家族。当前第54页\共有93页\编于星期三\2点蛋白质结构与功能分析当前第55页\共有93页\编于星期三\2点果蝇甲虫蜜蜂当前第56页\共有93页\编于星期三\2点基因功能研究方法：实验方法当前第57页\共有93页\编于星期三\2点当前第58页\共有93页\编于星期三\2点无论研究什么生物现象，都需要做一件事：改变基因1）Lossfunction：降低基因或删除基因Givefunction:提高基因的表达3.3基因功能的检测当前第59页\共有93页\编于星期三\2点3.1.3基因失活是基因功能分析的主要手段使特定基因失活的最简单方法是用一段无关DNA片段将其破坏。两个DNA分子具有相似序列，重组能引起分子片段进行互换。当前第60页\共有93页\编于星期三\2点当前第61页\共有93页\编于星期三\2点当前第62页\共有93页\编于星期三\2点美英三科学家因干细胞研究的贡献获诺贝尔医学奖马利欧·卡佩奇埃文斯奥利弗·史密斯当前第63页\共有93页\编于星期三\2点3.2.3

基因

过表

达用

于功

能检

测当前第64页\共有93页\编于星期三\2点划时代的基因靶向操作技术：

CRISPR/Cas9

经典基因操作：Genetrap:化学诱变；同源重组：一般物种几率低,10-6；EScell10-2突破性的发现：RNAi-Knockdown;不完全敲除，临时性充满梦想却幻灭的ZFN：难以完全找到匹配的3连子锌指；Off-target严重

美国加州大学DaveSegal教授说：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”完美基因靶向操作：识别特异DNA序列+操作DNA的酶当前第65页\共有93页\编于星期三\2点细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并进行有效的靶向DNA剪切。CRISPR/Cas9SystemClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat成簇的规律间隔的短回文重复序列.SorekR.etal.NatRevMicrobiol.2008，6(3):181-186当前第66页\共有93页\编于星期三\2点CRISPR/Cas9作用机理BarrangouR.NatureBiotech.2012:30,836–838PAM：protospaceradjacentmotifs前间区序列邻近基序，2–4nt；

TypeIITypeITypeIIICas9+sgRNACRISPR/Cas9RGN当前第67页\共有93页\编于星期三\2点CRISPR/Cas9应用当前第68页\共有93页\编于星期三\2点3.4高通量基因功能的研究方法

同源重组并不是唯一的打断基因的方法。另一种方法是用转座子标记技术，通过向基因中插入转座元件或转座子使其失活。人工诱导转座当前第69页\共有93页\编于星期三\2点3.4.1突变库构建1)利用天然的DNA转座子构建表达载体，转化受体细胞,当转座子活化时可被动转座并随机插入受体细胞基因组引起基因突变.2)观测突变再生植株的表型变化,分离与克隆插入突变基因的结构与功能.当前第70页\共有93页\编于星期三\2点植物DNA转座子当前第71页\共有93页\编于星期三\2点突变库表达载体当前第72页\共有93页\编于星期三\2点突变库表达载体元件的功能1)

Ac-载体:转座酶表达载体,由于缺少两侧反向重复边界顺序,不能主动转座.2)DsE-载体:捕获增强子表达载体.。两侧含转座子Ac-Ds的边界顺序,在转座酶作用下可被动转座,插入到启动子下游.当前第73页\共有93页\编于星期三\2点转座子标记技术很难瞄准单个基因，因为转座是一种随机事件，它更适用于整体研究基因组的功能，通过检查感兴趣表型变化的后代来鉴定出具有相似功能的各类基因。当前第74页\共有93页\编于星期三\2点

RNAi与基因功能检测RNAi是一种完全不同的基因失活方法，它并不打断基因本身，而是破坏其mRNA。当前第75页\共有93页\编于星期三\2点如何发现RNAiRNA干扰现象最初发现于1995年，Cornell大学的研究人员Guo和Kemphues研究阻断秀丽新隐杆线虫中的par-1基因时，利用反义RNA(AntisenseRNA)技术特异性地阻断par-1基因的表达，同时在对照实验注射正义RNA（SenseRNA）以期观察到基因表达的增强。但结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径,这与传统上对反义RNA技术的解释相矛盾，但他们没能给出合理解释。直到1998年2月，安德鲁AndrewFire和克雷格CraigMello首次揭开谜底，并把这种现象首次命名。他们证实，Guo等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去有关反义RNA对基因表达的阻断都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA(DoubleRNA,dsRNA)而引起。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫，发现基因抑制效应十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。当前第76页\共有93页\编于星期三\2点线虫RNAi实验

当前第77页\共有93页\编于星期三\2点目前已发现两种RNAi抑制靶基因表达的现象:1)siRNA:小分子干扰RNA,主要产生于双链RNA分子,在细胞内它们被切成短链RNA,然后与靶mRNA序列结合,导致mRNA的进一步降解。2)miRNA:微小干扰RNA,主要来自mRNA链内配对产生的双链RNA，在细胞内它们被切成短链RNA，然后与靶mRNA序列结合,使mRNA的翻译受阻或使mRNA降解。有两种RNAi现象：当前第78页\共有93页\编于星期三\2点microRNA干扰通路