响应面优化微波辅助固定化酶-化学法提取并分析常见主食膳食纤维含量及合理化饮食建议

响应面优化微波辅助固定化酶-化学法提取并分析常见主食膳食纤维含量及合理化饮食建议摘要随着人们生活水平的提高，大家对高热量、高蛋白、高脂肪食品和精细食品摄入量大大增加，膳食纤维（Dietaryfiber）的摄入量相对减少，忽略了膳食营养的平衡性。而膳食纤维作为“第七大营养素”具有降低血液中的胆固醇含量，促进肠道蠕动，清除体内毒素，进而有效防止结肠癌等病症发生的作用。虽然膳食纤维有很多的好处，但不宜过量。过量食用膳食纤维会影响其他营养物质的吸收，且容易引发肠阻塞甚至胃穿孔，特别是患有胃炎的人群更应当减少粗膳食纤维的摄入，防止对胃黏膜的进一步破坏，预防急性胃穿孔。我们组为优化不同人群的饮食结构，拟定以山东人日常生活中常见的几种主食为原料，通过响应面法优化提取条件，采用微波辅助固定化酶-化学结合的方法，将粉碎后的样品经微波预处理后，用酶解法水解样品中的淀粉，滤去包埋了酶的凝胶珠防止酶的浪费，用化学法除去样品中的蛋白质和脂肪，进一步提取原料中的膳食纤维，运用origin软件，对不同煎饼中膳食纤维含量进行分析，并绘制膳食纤维含量差异回归分析图等图表。本实验通过微量物重分析法表征不同煎饼中膳食纤维含量差异，从而为山东人合理搭配饮食提供可靠的数据支持。关键词:膳食纤维主食响应面固定化酶酶-化学法1前言1.1本研究的背景与意义1.1.1研究背景随着我国经济的快速发展，人们的生活水平稳步提高。但由于饮食不当而引起的相关疾病，也不断出现。2013年1月22日，美国癌症协会（AmericanCancerSociety，简称ACS）最新癌症统计数据（《2013年癌症事实与数字》）指出：发病率最高的三大癌症是肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌。尤其是结肠癌的发病率，正逐年上升。近年来，相关研究表明，食物中的膳食纤维可以有效预防结肠癌的发生。而由于地区饮食习惯的不同也导致人们对膳食纤维的摄入量不同，进而各地的发病率也有很大的差异。另外，膳食纤维还具有降低血脂，预防冠心病，改善糖尿病状况等作用。我国营养学会颁布《中国居民膳食营养素参考摄入量》规定，成人膳食纤维日摄入量为30g左右，而我国居民膳食纤维实际摄入量仅为14g左右。然而，特殊的人群有对膳食纤维特殊的要求，例如儿童和老人应当适量减少，每日食用量最好不要超过18g。患有肠胃病的人群应当减少膳食纤维的摄入，特别是粗膳食纤维，防止造成胃粘膜进一步破损，甚至急性胃穿孔。而当今快节奏的社会生活，上班族，学生族不规律饮食，导致肠胃病高发，而关注肠胃病人群合理饮食显得刻不容缓。1.1.2研究的意义近年来，尽管相关人士对膳食纤维的研究比较深入，但对饮食中的膳食纤维研究以及给消费者提供合理的膳食建议等方面还很不完善。为此，本研究通过对不同煎饼中膳食纤维的提取及含量的测定，以期为大家提供合理的饮食方案，达到对膳食纤维摄取的最适量，增强身体素质，减少过量食用造成的危害。1.2膳食纤维简介膳食纤维作为目前国内外营养学研究的重点之一，被誉为人类的第7大营养素。膳食纤维虽然不可被人体消化吸收，但它可以促进肠道的蠕动，预防便秘。另外，提高膳食纤维的摄入量，可以减少热量的摄取，有利于减肥。而膳食纤维最主要的功效是能够有效预防结肠癌和直肠癌。除此之外，膳食纤维还具有降低血脂，预防冠心病，改善糖尿病症状，改善消化系统等作用。但是，过量食用也可能造成不必要的危害。如果每天都能够摄取适量的膳食纤维以及其他人体所必需的物质，加上适当的体育锻炼，长此以往，国民身体素质会有质的提升。1.3固定化酶-化学法目前国内外提取膳食纤维的方法主要有AOAC法、膜分离法、热水提取取法、发酵法、化学法和酶法等方法。相对于前几种方法而言，化学法和酶法具有一定的优势，而单一的化学法和酶法都有其难以克服的弊端。本研究就是在此基础上，把酶法和化学法结合，集中两种方法的优点，更有效的提取膳食纤维。固定化酶-化学法就是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基因将酶交联起来，而形成相对分子质量更大、不溶性的固定化酶。而酶的活性不受影响，并且可以增加对酸、碱和温度等的稳定性，具有一定的机械强度。此外，还具有易于从反应体系中分离，而且易于控制，能够反复多次使用，降低酶的成本的优点。1.4响应面优化法本研究通过响应面分析法来优化提取的工艺，相对于传统的正交法，响应面法是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。它具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究集中因素交互作用等优点。在本研究中，使用此方法能过明显提高膳食纤维的提取率，是研究结果更具有说服力、更接近实际。2实验目的通过响应面法优化膳食纤维的提取工艺。通过固定化酶技术实现酶的回收再利用。采用酶-化学法提取不同煎饼中的膳食纤维。对比分析不同主食的膳食纤维含量,给泰安市喜好煎饼的市民一个合理化的饮食建议。3实验原理膳食纤维（Dietaryfiber，DF）主要由可食性植物细胞壁残余物（纤维素、半纤维素、木质素等）及与之缔合相关物质组成化合物，一般不能被人体消化酶消化。根据水溶性不同，膳食纤维可被分为水溶性膳食纤维（SDF）和水不溶性膳食纤维（IDF）。SDF包括β–葡聚糖和阿拉伯木聚糖，IDF包括木质素、纤维素和半纤维素。不溶性膳食纤维的分子结构如下：（主要为纤维素）可溶性膳食纤维的结构如下：（主要为β-葡聚糖）微波预处理是利用频率为300-300000MHz的电磁波辐射提取物，再交频磁场、电场作用下，提取物内的极性分子取向随电场方向改变而变化，从而导致分子旋转、振动或摆动，加剧反应物分子运动及相线间的碰撞频繁率，使分子在极短时间内达到活化状态，比传统加热式均匀、高效。微波提取过程的原理主要有二个方面：一是强化了传递过程，热量通过微波转换得到而不存在传递的问题，从而实现高强度的均匀加热。二是植物内介电系数较大的极性分子吸收微波产生热量，发生汽化或膨胀，内渗透压增加而破坏植物的细胞结构,使扩散孔道变大，提取速度发生根本性变化。植物结构被破坏是提高提取效率的主要方法。固定化酶技术是为了提高酶的利用率，将酶通过一定的的理化作用，将其固定在聚合物或者载体上并保持其活性。固定化酶技术在在该实验中的应用提高了产物的纯度，具有充分利用资源，节省能源等优点。通过固定化的酶使淀粉分解为葡萄糖、糖醛酸等单糖后溶解除去，得到滤液，用乙醇沉淀即得SDF；去除淀粉后运用化学碱法即采用氢氧化钠浸泡可使其中的蛋白质和脂肪发生水解或增溶（前者在碱的作用下降解为可溶性的小分子肽和游离氨基酸，脂肪在碱性条件通过皂化反应，水解为甘油和脂肪酸的盐类，从而更容易漂洗除去），以提高膳食纤维的纯度，漂洗过滤干燥即得IDF。分别分析IDF和SDF分量，作为依据，为大家提供合理化的饮食建议。4实验设备序号设备及用品名称规格数量1高速中药粉碎机(打粉机)单次粉碎量10-800克，细度20-200目12移液器量程：0.05mL-5mL3量筒4电子分析天平精确度：0.0001g5玻璃棒56烧杯7电恒温水浴锅0-100℃18真空抽滤机泵或高速离心机19容量瓶量程：200ml510注射器（带针头）自备11温度计量程：0-100℃12铁架台5实验材料及试剂5.1试剂的配制序号试剂及药品配制用量1盐酸（1mol/L）2氢氧化钠（1%-2%）3无水乙醇4过氧化钠5蒸馏水6海藻酸钠5.2酶制剂列表序号名称最适温度/℃最适pH用量1α-耐热淀粉酶906-85.3材料的处理将选取的馒头、米饭、玉米煎饼、小米煎饼干燥粉碎干燥过筛。6实验操作步骤6.1前期准备中心组合设计（CCD）实验单因素实验中心组合设计（CCD）实验单因素实验PB实验最陡爬坡实验通过上述实验设计，得到最终最优提取条件，在最优条件下进行实验。加ccd组合实验表：空着数据不填，加说明结果怎么分析，用何软件6.2工艺流程过滤除酶碱液除去蛋白质及脂肪固定化淀粉酶水解粉碎，微波预处理过滤除酶碱液除去蛋白质及脂肪固定化淀粉酶水解粉碎，微波预处理乙醇沉淀上清液(SDF)乙醇沉淀上清液(SDF)干燥，称量DF抽滤法过滤（或离心）分离干燥，称量DF抽滤法过滤（或离心）分离脱色洗涤沉淀物（IDF）脱色洗涤沉淀物（IDF）6.3实验材料的准备与预处理6.3分别称量各样品适量（约50g）粉碎全部过40目筛，放入密闭容器中，防止试样成分变化，标号1-A、1-B、2-A、2-B、3-A、3-B、4-A、4-B（即每个样品设置2个平行样）待用。6.3将上述样品放入微波炉内用微波进行预处理5min。6.4样品的测定6.4取样品1-A、1-B、2-A、2-B、3-A、3-B、4-A、4-B各10g粉末经固定化的a-耐热淀粉酶设定水浴温度65℃,酶解1h，均匀搅拌。水解除去淀粉后，纱布过滤出去凝胶珠。6.4取100ml氢氧化钠溶液于样液中，在75℃电热恒温水浴锅水浴30min。30min后取盐酸溶液调节样液pH值至中性pH=7浸泡片刻。然后进行高速离心（或三次抽滤）。沉淀物：加入50ml过氧化钠混合液，混合均匀，浸泡30min脱色，随后用盐酸调节pH至中性，过滤烘干并称重。即得样品中不溶性膳食纤维质量。上清液：加入4倍于滤液的无水乙醇沉淀10min，用滤纸过滤，烘干沉淀物，称重。即得样品中水溶性膳食纤维质量。7结果及计算样品测量值1-A1-B2-A2-B3-A3-B4-A4-BSDF重量均量IDF重量均量DF总量公式：DF=SDF+IDF膳食纤维含量：DF%=(a+b)/10*100%8注意事项固定化酶水解一般需要的时间稍微长一些。回收的凝胶珠应当妥善低温保存。水解操作中控制好温度、PH等条件。高速中药打碎机的使用过程中应当注意安全。9费用预算(单位：人民币)物品名称规格用量（g）费用预算（元）原料100g/种40015酶试剂4000u/g20200（已自备）其它12费用合计227参考文献JohnSeffrin.2013年癌症事实与数字AmericanCancerSociety2013AnneS.Meyer,BirgitteP.Dam,HelleN.Larke.Enzymaticsolubilizationofapectinaceousdietaryfiberfractionfrompotatopulp:Optimizationofthefiberextractionprocess[J]BiochemicalEngineeringJournal2009,4.3汪志慧等响应曲面法优化双酶法提取莲房原花青素食品安全2011王秀奇等基础生物化学实验高等教育出版社1999年版JoanneL.Slavin.Dietaryfiberan