动物细胞工程使用演示文稿

动物细胞工程使用演示文稿当前第1页\共有44页\编于星期三\0点优选动物细胞工程使用当前第2页\共有44页\编于星期三\0点一、动物细胞培养的应用和概念：1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.2、原理：细胞增殖当前第3页\共有44页\编于星期三\0点定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3：过程图示原代培养当前第4页\共有44页\编于星期三\0点强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。当前第5页\共有44页\编于星期三\0点■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制当前第6页\共有44页\编于星期三\0点当前第7页\共有44页\编于星期三\0点

定义：当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养当前第8页\共有44页\编于星期三\0点3、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制（分解细胞）当前第9页\共有44页\编于星期三\0点

细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种10-50代的传代细胞为细胞株。

细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种50代以上的传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。当前第10页\共有44页\编于星期三\0点细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养知识点小结：各个新名词之间的联系多数组织细胞固定在表面生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖当前第11页\共有44页\编于星期三\0点4.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒的环境：

适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。适宜的酸碱度：PH：液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。当前第12页\共有44页\编于星期三\0点.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中必需氨基酸动物细胞本身不能合成，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等以及多种生长因子，能促进细胞的生长、增殖和贴附。

当前第13页\共有44页\编于星期三\0点问题3：为什么用胰蛋白酶处理？问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。

问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为，胰蛋白酶作用的适宜PH为，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为的动物细胞培养中无活性。问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。当前第14页\共有44页\编于星期三\0点问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体问题8、动物细胞培养的原理：细胞增殖。问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。当前第15页\共有44页\编于星期三\0点植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花药胚胎或幼龄动物的器官或组织其他条件无菌无毒，适宜条件无菌无毒，适宜条件当前第16页\共有44页\编于星期三\0点5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性

4.细胞的生理、药理、病理研究

如用于筛选抗癌药物当前第17页\共有44页\编于星期三\0点二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：

动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类：

胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理：

动物细胞核具有全能性当前第18页\共有44页\编于星期三\0点卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫（代孕母体）胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程重组细胞当前第19页\共有44页\编于星期三\0点4、体细胞核移植过程---动物克隆---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕受体当前第20页\共有44页\编于星期三\0点黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核a重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利1、写出ab所代表细胞工程名称：a表示：

b表示:

2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。3、多利面部毛色是：

根据遗传学原理说明判断依据。4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为

核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都来自白面绵羊aa当前第21页\共有44页\编于星期三\0点电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎卵母细胞采集、培养MⅡ期卵母细胞供体牛供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植体细胞核移植过程

（体细胞克隆动物）当前第22页\共有44页\编于星期三\0点多莉羊诞生的意义：

多莉羊在技术上的突破之处在于供核细胞不是胚胎细胞，而是已分化的体细胞。这说明已经分化的动物体细胞核，仍然具有全能性，在合适的条件下，就可以发育成新的个体。 克隆技术在繁育优良家畜、治疗人类遗传病、抢救濒危物种和保护生物多样性等方面有广阔的应用前景。当前第23页\共有44页\编于星期三\0点１、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变思考题3、用于核移植的为什么要选择减数第二次分裂中期的细胞？选择减二中期的卵母细胞的优点：体积大，易操作，含有大量的促使细胞核体现全能性的物质和条件。当前第24页\共有44页\编于星期三\0点3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞思考题当前第25页\共有44页\编于星期三\0点3.体细胞核移植技术的应用前景：1.加速家畜遗传改良的进程2.保护濒危物种3.生产医用蛋白质及组织器官的移植4.了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病当前第26页\共有44页\编于星期三\0点体细胞核移植技术存在的问题：许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。当前第27页\共有44页\编于星期三\0点动物细胞融合与单克隆抗体当前第28页\共有44页\编于星期三\0点1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。当前第29页\共有44页\编于星期三\0点

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合

受精作用当前第30页\共有44页\编于星期三\0点动物细胞融合当前第31页\共有44页\编于星期三\0点2、诱导融合的因素生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.物理法：电激融合病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜连接细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞当前第32页\共有44页\编于星期三\0点3、动物细胞融合技术的应用细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。当前第33页\共有44页\编于星期三\0点思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？

因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。当前第34页\共有44页\编于星期三\0点人们获得抗体的传统方法是?将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用

——单克隆抗体的制备思考当前第35页\共有44页\编于星期三\0点单克隆抗体的制备—极富创造性的方案将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。当前第36页\共有44页\编于星期三\0点杂交细胞灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞经免疫的小鼠提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体当前第37页\共有44页\编于星期三\0点动物特异性免疫分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn）细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列

，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：当前第38页\共有44页\编于星期三\0点3）、为何要进行两次筛选？4）、如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：1）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体当前第39页\共有44页\编于星期三\0点1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.2、用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）2、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。3、单克隆抗体的应用当前第40页\共有44页\编于星期三\0点例题1：1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”

在一起，说明细胞膜

。(2)单克隆抗体的准确定义应为()A．一类特殊抗体B．无性繁殖系

C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体

D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂，其遗传性状__________。(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了

_____________

。具有一定的流动性C有丝不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点当前第41页\共有44页\编于星期三\0点[例题2]（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选)

（）

A．T淋巴细胞B．效应B淋巴细胞

C．抗体D．记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是(多选)（）

A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导

B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克隆抗体

C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不能无限增殖

D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性明显

BCD

ACD当前第42页\共有44页\编于星期三\0点已知细胞合成DNA有D和