利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂演示文稿

利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂演示文稿当前第1页\共有48页\编于星期三\0点利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂当前第2页\共有48页\编于星期三\0点汇报提纲研究背景、目的

研究技术路线与方法结果与分析

结论

有待进一步研究的问题当前第3页\共有48页\编于星期三\0点一、研究背景及目的应激夏季高温对养猪生产的影响高温与胃肠道损伤修复基因芯片在猪热应激中的应用当前第4页\共有48页\编于星期三\0点应激的种类饲管因素运输因素

环境因素

防治因素

中毒因素

心理因素

其他因素

随着全球性气候变暖，高温成为对家畜作用最广泛和不可避免的应激因素。人工气候室高温模型符合试验因子单一化研究应激机制。当前第5页\共有48页\编于星期三\0点热应激环境温度超过猪的等热区上限，猪体温超过39.5℃，产热大于散热。免疫机能生产性能经济损失生理指标行为改变胃肠道损伤当前第6页\共有48页\编于星期三\0点应激与应激性溃疡应激性溃疡：应激中机体为了保护心、脑等重要器官，全身血液重新分配，胃肠道血流量明显减少。导致小肠黏膜急性损伤，因此，肠道是应激反应的中心器官。当前第7页\共有48页\编于星期三\0点高温与肠黏膜屏障的损伤修复小肠黏膜屏障结构的完整性免疫功能——第一道防御屏障生产性能——营养物质吸收利用当前第8页\共有48页\编于星期三\0点基因芯片在猪热应激中的运用基因芯片（基因微阵列）cDNAmicroarrayAffymetrixGeneChip®PorcineGenomeArray，包含23,937个探针组，代表20,201个基因。应用猪全基因组已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，对23937个探针以及杂交信号进行灵敏、准确的检测分析，实时同步高通量评价猪的热应激反应。当前第9页\共有48页\编于星期三\0点实时同步高通量评价猪的热应激基因芯片热应激从猪热应激及中药两个角度对多参数实时同步分析，探讨热应激机制并发掘药物靶点，为多层次评价中药作用提供工具。改善环境营养调控抗热应激药物（中药添加剂）中药当前第10页\共有48页\编于星期三\0点研究目的、意义通过猪在人工气候室连续10天26-40℃的循环变温刺激，从小肠黏膜形态学、与损伤修复相关的EGF/EGFR等生长因子与mRNA水平以及信号通道等方面探讨高温对猪小肠黏膜结构损伤的影响及中药调控机制，为开发抗热应激中药添加剂以及小肠损伤修复剂奠定基础。当前第11页\共有48页\编于星期三\0点二、技术路线和方法实验动物：48头2月龄、体重7.15±0.61kg的中国实验用小型猪（CEMP,农大I系）。

人工气候室：中国农科院畜牧兽医研究所动物营养国家重点开放实验室。石香颗粒：功效为防治高温引起的机体免疫力下降及生产性能下降。其中盐酸小檗碱含量1.0mg/g。用法：饮水；用量：0.15g/kg·bw。连用10天。

主要药味包括苍术(RhizomaAtractylodis)、藿香(HerbaAgastachis)、黄柏(CortexPhellodendri)、石膏(GypsumFibrosum)等。当前第12页\共有48页\编于星期三\0点退热及中枢镇痛作用增强巨噬细胞吞噬功能增强细胞和体液免疫功能抗菌、镇痛、解热作用促进胃液分泌，解除胃肠痉挛燥湿健脾。用于脘腹胀满，泄泻，水肿.调节胃肠运动，调节黏膜免疫抗病原微生物、抗溃疡作用、抗菌、清热燥湿免疫调节作用苍术藿香黄柏石膏石香颗粒当前第13页\共有48页\编于星期三\0点技术路线21000，41000个基因猪热应激模型大鼠热应激模型模型评价小肠形态结构观察基因芯片分析关键的调节因子相关性分析IEC-6细胞热应激模型细胞形态、活力、凋亡生长因子表达变化ERK1/2信号通路的变化相关性分析10个生长因子和ERK1/2信号通路当前第14页\共有48页\编于星期三\0点技术路线小肠形态学观察高温组体内体外生产性能生理指标肠上皮细胞组织学观察IEC-6形态学观察ERK1/ERK2细胞活力/细胞周期中药组对照组损伤指标观察临床观察基因芯片评价生长因子mRNA信号通道Pathway分类EST分析功能分析（GO分类）高通量快速筛选平台当前第15页\共有48页\编于星期三\0点三结果与分析NameAvg.TemperatureMin.TemperatureMaxTemperatureStandardDeviationEmissivityControl35.4°C27.4°C38.3°C0.740.95HeatStress37.4°C28.9°C39.5°C0.580.95（一）高温模型及对猪小肠黏膜形态结构的损伤及中药的修复作用当前第16页\共有48页\编于星期三\0点热应激前后猪肛温变化热应激前后血清皮质醇变化当前第17页\共有48页\编于星期三\0点直肠温度及平均日增重Table.Rectaltemperatureandaveragedailygain注：同行小写字母相同者代表组间差异不显著；不同者代表组间差异显著(P<0.05)当前第18页\共有48页\编于星期三\0点热应激猪小肠黏膜的形态学变化左列为对照组中列为高温组右列为中药组上行为十二指肠中行为空肠下行为回肠当前第19页\共有48页\编于星期三\0点高温对猪空肠上皮细胞结构的影响A为对照组，B为高温组；10000×电镜显示，小肠微绒毛变短；细胞核没有明显变化；线粒体、转运小泡及次级溶酶体数量增加。50000×电镜显示空肠上皮细胞内线粒体数量增加，线粒体内部脊突变短，肿胀，内部已有空泡形成；次级溶酶体数量增加，从形态上显示，膜包被的电子密度不同的多胞体结构清晰可见；在没有脱落的空肠上皮细胞间紧密连接以及细胞核没有明显变化。

50000×10000×当前第20页\共有48页\编于星期三\0点热应激猪空肠组织基因表达谱变化对照组高温组RNA提取反转录cDNAcRNA合成芯片杂交生物学分析芯片验证EST分析GOMAPPING分析PATHWAY分析中药组验证（二）高温对猪空肠黏膜基因差异表达的影响当前第21页\共有48页\编于星期三\0点差异基因比较结果AffymetrixGeneChip®PorcineGenomeArray含有23,937条探针代表已知猪的20,201个基因。高温组与对照组比较（差异倍数＞±2.0）基因基因数量比例%表达基因1632171.6%不表达基因630327.6%表达上调930.41%表达下调1100.49%临界基因1860.8%当前第22页\共有48页\编于星期三\0点差异基因的聚类分析当前第23页\共有48页\编于星期三\0点差异基因列表探针号变化倍数基因库编号基因名称当前第24页\共有48页\编于星期三\0点荧光定量PCR验证变化趋势一致，芯片数据可靠当前第25页\共有48页\编于星期三\0点差异基因GO分类图细胞过程磷酸化过程细胞成分细胞蛋白结合发育刺激反应调节生物进程信号转导激活蛋白复合物繁殖其它反应激活细胞器细胞器成分胞外区GO名总数百分率GO分类：细胞成分，生物进程，分子功能三大类。当前第26页\共有48页\编于星期三\0点差异基因分子功能分析当前第27页\共有48页\编于星期三\0点差异基因生物进程分析当前第28页\共有48页\编于星期三\0点细胞组分分析当前第29页\共有48页\编于星期三\0点差异基因的Pathway分析当前第30页\共有48页\编于星期三\0点主要的生长因子Epidermalgrowthfactor(EGF)表皮生长因子

Bonemorphogeneticproteins(BMPs)骨形成蛋白Erythropoietin(EPO)红细胞生成素Fibroblastgrowthfactor(FGF)成纤维细胞生长因子Granulocyte-colonystimulatingfactor(G-CSF)粒系集落刺激因子Growthdifferentiationfactor-9(GDF9)生长分化因子-9Hepatocytegrowthfactor(HGF)肝细胞生长因子Insulin-likegrowthfactor(IGF)胰岛素样生长因子Growthdifferentiationfactor-15(GDF-15)生长分化因子-15Nervegrowthfactor(NGF)神经生长因子Platelet-derivedgrowthfactor(PDGF)血小板衍生生长因子Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)血管内皮生长因子当前第31页\共有48页\编于星期三\0点差异基因net图当前第32页\共有48页\编于星期三\0点（三）体外IEC-6热应激模型及高通量快速筛选抗应激添加剂模型的建立及评价热应激和ERK1/2信号通路对大鼠IEC-6细胞生长因子表达的影响热应激对大鼠空肠和IEC-6细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平的影响利用体外IEC-6热应激评价平台和差异显示生长基因高通量筛选抗应激中药活性部分——苍术、藿香挥发油

当前第33页\共有48页\编于星期三\0点热应激对IEC-6细胞形态结构、增殖活力和凋亡的影响当前第34页\共有48页\编于星期三\0点热应激和ERK1/2信号对大鼠IEC-6细胞生长因子表达的影响当前第35页\共有48页\编于星期三\0点大鼠空肠和IEC-6细胞ERK1/2的磷酸化水平当前第36页\共有48页\编于星期三\0点高温对IEC-6细胞活力、细胞增殖指数及

中药有效部分的影响组别GroupsG0/1期细胞G0/1cell(%)G期细胞Gcell(%)S期细胞Scell(%)增殖指数PI(%)细胞活力(OD570)对照组CG74.2±3.1b6.9±2.6a18.8±3.9a25.8±3.1a0.757±0.010a高温组HTG84.4±3.5a4.7±1.8b10.9±1.7c15.6±3.5c0.737±0.005b苍术油组RHAAG77.7±1.4b6.0±1.2a16.2±2.5ab22.2±1.4a0.750±0.008a藿香油组HAAG80.1±0.8a6.4±2.2a13.5±1.5c19.9±0.8b0.754±0.005a注：同列小写字母相同者代表组间差异不显著；不同者代表组间差异显著(P<0.05)当前第37页\共有48页\编于星期三\0点IEC-6在高温中EGF/EGFRmRNA的变化及中药调控当前第38页\共有48页\编于星期三\0点中药对IEC-6在高温中P-ERK1/ERK2的影响当前第39页\共有48页\编于星期三\0点小结1、热应激导致大鼠IEC-6细胞形态损伤，降低细胞增殖活力，诱导细胞凋亡。2、热应激诱导大鼠空肠和IEC-6细胞的ERK1/2信号蛋白磷酸化，并改变IEC-6细胞生长因子的表达水平。3、抑制ERK1/2蛋白磷酸化后，热应激引起更为严重的细胞损伤，诱导更为严重的细胞凋亡。4、热应激时ERK1/2信号参与生长因子表达的调节。5、体外细胞应激模型可以作为高通量筛选中药有效部分的平台当前第40页\共有48页\编于星期三\0点四.结论热应激猪26～40℃循环高温模型成立。石香颗粒通过调节猪体温，减少小肠上皮细胞、肠绒毛损伤，石香颗粒通过维护小肠黏膜屏障的完整性和营养吸收功能，发挥抗热应激作用。热应激导致猪空肠基因表达差异。芯片HSPs、EGF、EGFR等生长因子mRNA验证结果表明可靠。这些差异基因涉及机体内分泌、免疫功能、细胞损伤和修复、细胞凋亡、信号转导等。当前第41页\共有48页\编于星期三\0点Pathway分析预测花生四烯酸代谢途径、淀粉和蔗糖代谢途径、亚麻仁油酸代谢途径、细胞色素P450代谢途径和MAPK信号通路在热应激过程中发挥重要作用。猪小肠黏膜损伤修复的基因信号通道与EGF介导的细胞的损伤，修复相关。石香颗粒主要成分通过显著促进对EGFR的表达，启动基因转录，促进细胞增殖，损伤的修复。当前第42页\共有48页\编于星期三\0点五.有待进一步研究的问题高温对猪空肠的基因差异表达基因为203个；其中上调有的93个；下调的有110个。继续进行高温对猪热应激影响机制的研究，开发抗热应激和小肠黏膜损伤修复剂。当前第43页\共有48页\编于星期三\0点当前第44页\共有48页\编于星期三\0点当前第45页\共有48页\编于星期三\0点与动物热应激中肠黏膜屏障相关的SCI论文LiuFH,YinJD,DuM,YanPS,XuJQ,ZhuXY,YuJ.HeatStressinducedDamagetoPorcineSmallIntestinalEpitheliumassociatedwithDown-RegulationofEpithelialGrowthFactor(EGF)Signaling.JournalofAnimalScience.2009,6(87):1941-1949,IF2.466.YuJin,YinPeng,LiuFenghua..InvolvementofERK1/2signalingpathwayinheatstress-induceddamageandexpressionchangeofgrowthfactorsinratjejunumandIEC-6cells.International

Journal

of

Hyperthermia.2010，10;26(6):538–555.IF2.713.SongXZ,XuJQ,WangT,LiuFH.Chinesemedicinegranuleaffectstheabsorptionandtransportofglucoseinporcinesmallintestinalbrushbordermembranevesiclesunderheatstress.Asian-Australasianjournalofanimalsciences.2009,20：246-254.IF0.875SongXZ,XuJQ,WangT,LiuFH.TraditionalChinesemedicinedecoctionenhancesgrowthperformanceandintestinalglucoseabsorptioninheatstressedpigsbyup-regulatingtheexpressionsofSGLT1andGLUT2mRNA.2009.LivestockScience.128(2010)75–81)IF1.41JinYu,PengYin,FenghuaLiu,XiaoyuZhu,GuilinCheng,AnLu,WeiliLuan,JianqinXu.Effectofheatstressonporcinesmallintestine:astudyofmorphologicalandgeneexpression.ComparativeBiochemistryandPhysiology,PartA156(2010)119–128.IF2.196.JinYu,PengYin,FenghuaLiu,IntegratingmiRNAandmRNAExpressionProfilesinRespon