抗病毒药物耐药及耐药机制研究进展

抗病毒药物耐药及耐药机制研究进展

【关键词】,抗病毒药；,,耐药性；,,耐药机制

摘要：目前临床应用的抗病毒药物达40多种，为病毒引起的疾病的治疗发挥了重大作用。与临床其他抗感染药物一样，抗病毒药物长期应用易产生耐药性，降低疗效，成为临床治疗及新药开发的重要问题。本文就抗艾滋病毒药物、抗乙型肝炎病毒药物、抗流感病毒药物及抗疱疹病毒药物耐药性及耐药机制研究进行综述。

关键词：抗病毒药；耐药性；耐药机制

Advancesinantiviraldrugresistanceandresistancemechanisms

ABSTRACTTherearemorethan40antivirusdrugsintheclinicaluse,whichhaveplayedveryimportantroleinthetreatmentofviraldiseases.Likeotherkindofantiinfectiondrugs,antivirusdrugscanalsoinduceresistanceinlongtimeusethatresultsthereducingoftherapeuticefficacyandbecomingaverytoughproblemintheclinicaltreatmentandthedevelopmentofnewdrugs.ThispaperbrieflyreviewedtherecentadvancesinresistanceandresistancemechanismsofantiHIVdrugs,antiHBVdrugs,antiinfluenzadrugsandantiHSVdrugs.

KEYWORDSAntivirusdrugs;Resistance;Resistancemechanisms

病毒性传染病居传染病之首(占60%以上)，发病率高、传播快，对人类健康形成莫大的威胁。如艾滋病(AIDS)、重症急性呼吸系统综合征(SARS)，各种病毒性肝炎、流行性出血热、流感、感冒、婴幼儿病毒性肺炎、成人腹泻、病毒性心肌炎等等。近20年来，尤其是20世纪90年代，抗病毒药物发展突飞猛进，目前在临床应用的抗病毒药物达40多种［1］，为治疗病毒引起的感染发挥了重大作用。与临床其他抗感染药物一样，抗病毒药物长期应用易产生耐药性，降低疗效，病情复发，成为临床治疗及新药开发的重要问题。本文就各类临床应用抗病毒药物耐药性及耐药机制研究进展介绍如下。

1抗艾滋病药1抗艾滋病药的作用靶点［2］艾滋病毒(HIV)复制过程中有三个由病毒基因编码的复制关键酶，即逆转录酶(reversetranscriptase,RT)、蛋白酶(protease,PR)及整合酶(integrase)，它们均为发展抗艾滋病毒药物的重要靶点。目前上市抗HIV品种有21个，针对前两个酶的抗艾滋病毒药物可分为核苷类逆转录酶抑制剂，非核苷类逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂三类。第四类为HIV入胞抑制药。2核苷类逆转录酶抑制剂(nucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NRTI)耐药性及耐药机制属于NRTI的抗艾滋病毒药物共有8个品种，即齐多夫定(zidovudine，AZT)、去羟肌苷(didanosine，ddI)、扎西他滨(zalcitabine，ddC)、司他夫定(stavudine，d4T)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿巴卡韦(abacavir，ABC)、富马酸替诺福韦酯(tenofovirDF，TDF)、恩曲他滨(emtricitabine,FTC)。NRTIs均为DNA合成天然底物的衍生物，AZT及d4T为脱氧胸苷的类似物，ddC、3TC及FTC为脱氧胞苷的类似物，ddI及tenofovirDF为脱氧腺苷及开环脱氧腺苷酸的类似物，ABC为脱氧鸟苷的类似物，它们均需在细胞内转化为活性三磷酸或二磷酸衍生物，才能发挥抑制HIV1RT作用。它们全部是HIV1RT底物的竞争性抑制剂，抑制RT活性，阻碍前病毒DNA合成；并由于在结构上3′位缺乏羟基，当它们结合到前病毒DNA链的3′末端时，不能再进行5′→3′磷酸二酯键的结合,终止了病毒DNA链的延长，又为链末端终止剂。通过上述作用机制,抑制HIV复制。它们与HIV1RT亲和力远比与细胞内正常DNA聚合酶亲和力强，因此具有一定的治疗指数。艾滋病的治疗采用联合用药，即高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)。耐药突变［3］可分为基因型突变(genotype)及表型突变(phenotype)，基因型突变并不一定有表型突变，临床需分别进行两者检测。通常在RT分子中有一个氨基酸取代，即可引起表型突变。AZT是第一个上市的抗艾滋病药(1987年)，在临床应用时间较长，单个氨基酸取代可引起高度耐药突变的有M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F和K219E/Q，可使IC50降低100倍，其中以T215Y/F为最重要的取代［4，5］。这些取代也可发生在d4T单药治疗，但耐药程度较低，在ddI单药治疗患者，也有10%发生以上突变，对其他NRTIs无交叉耐药。这一系列耐药突变的机制主要为焦磷酸依赖及ATP依赖的焦磷酸解作用(pyrophosphorolysis，聚合的逆反应)，以后者为主［6～8］。突变的RT可将引物(primer)末端结合的AZTMP切除，去掉AZTMP的链末端终止作用(deblock)，使DNA链重新开始聚合反应而延长。有报道在生理浓度ATP条件下［9］，突变的RT对8个NRTI的切除能力次序为AZTd4TddCABCDAPD3TCddItenofovirDF，说明AZT及d4T主要通过ATP依赖的焦磷酸解修复机制产生耐药，对tenofovirDF此修复机制比AZT小35倍，比d4T小22倍。在有对应的新dNTP结合情况下，可抑制修复机制，但对AZT修复机制无影响，提示AZT这一系列耐药与其他NRTI无交叉耐药的机制。AZT与ddNs(指ddI及ddC)联合用药可发生另一系列的多药耐药突变，有多处取代(A62V、V75I、F77L、F116Y及Q151M)，其中以Q151M最重要。有3%～16%患者用AZT与ddI或ddC治疗可发生这类突变。体内对AZT敏感性下降为原有的1/179，对ddI、ddC及d4T的敏感性显着下降，但对3TC及tenofovir(TDF)仍敏感。Q151M及包含Q151M的突变RT的耐药机制为对ddNs的识别［10］，对ddNs的识别发生在RT活性中心的聚合过程，聚合效率降低，而不是在ddNs结合过程。在AZT突变的基础上(由胸腺嘧啶核苷衍生物AZT及d4T引起的突变称thymidineanaloguemutation，TAM)，还可发生插入或缺失突变［9，11］，产生高度耐药(1000倍)。在69与70残基之间插入两个氨基酸称69插入突变，发生率1%。插入可为SS、SG、SA，在β3β4环，包括氨基酸残基6472，位于RT的手指区，使手指区移动性加大，并应用ATP依赖的焦磷酸解作用。缺失突变发生在67位置，此突变RT的分子机制为对ATP有高度亲和力，在低浓度ATP条件下，可发挥ATP依赖的焦磷酸解作用，切掉AZTMP及TDFMP。其他NRTI亦可引起单个取代的耐药突变及交叉耐药，如ddC引起的K65R，对ABC、ddI及TDF均有交叉耐药，含K65R或L74V变异的病毒复制能力下降［12～14］，对天然底物利用能力比野株低，对dATP、dGTP、dTTP和dCTP利用能力分别下降15%、36%、50%和25%，聚合效率野株RTL74VRTK65RRTK65R/L74VRT。K65R可降低ddNTP分离的焦磷酸的稳定性。3TC引起的M184V，对3TC及FTC高度耐药(100倍)，与ddC及ddI有轻度交叉耐药，分子机制为此突变RT的巨大的侧链(Val)与3TC/FTC的氧硫环之间发生空间障碍，影响两者的聚合反应。3TC的耐药变异可逆转齐多夫定耐药株，使其恢复对齐多夫定的敏感性，并可延缓齐多夫定耐药变株之产生［15］。临床研究显示，3TC耐药株的出现对联合用药(3TC+AZT)疗效影响不大，故3TC+AZT为HAART常用组成部分。D4T引起的V75T与ddC及ddI有交叉耐药，分子机制为此突变RT由于空间障碍，降低d4TTP结合效率。临床分离到的ddI耐药变株，在HIV1RT有两种主要突变类型L74V及M184V，两者对ddI敏感性分别降至1/10及1/4～1/8。ddI耐药毒株与AZT无交叉耐药，与ddC有交叉耐药。体外研究显示ABC累积4个取代(K65R、L74V、Y115F、M184V)可产生高度耐药，分子机制为影响聚合效率。体外ABC与ddI、ddC及3TC可能有交叉耐药，与D4T及AZT无交叉耐药。TDF体内外不易产生耐药，主要为K65R突变，临床有3%患者可分离此突变株，其对TDF敏感性下降3～4倍，无交叉耐药，ddC、ddI及ABC也有

此突变。3非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NNRTI)耐药性及耐药机制属于NNRTI的抗艾滋病毒药物共有3个品种［奈韦拉平(nevirapine，NEV)、地拉韦平(delavirdine，DEL)和依非韦伦(efavirenz，EFV)］。NNRTI与接近活性中心的P66亚单位疏水口袋结合，与NRTI结合位置不同，是RT的非竞争性抑制药。NNRTI易引起耐药及交叉耐药［5，16］，常见引起耐药的单一取代有A98G、L100I、K101E、K103N、V106A、V108I、E138K、T139I、T181C、Y188C、G190A、F227L及P236L，以K103N最常见。单一取代显着引起空间障碍，降低NNRTI与RT的结合，如T181C对NEV敏感性降低100倍，并有交叉耐药。EFV为第二代NNRTI，其分子结构较小，可结合耐药RT已重新排列的疏水口袋。如NEV对K103N的结合亲和力下降40倍，EFV只下降6倍，因此EFV仍对耐药株有效。体内外NEV极易产生耐药，临床单药治疗8周，100%患者可分离出耐药变株。HIV1RT突变部位主要是密码子181［17］，由酪氨酸→胱氨酸/丝氨酸，NEV耐药株仍对齐多夫定敏感，但与其他非核苷类HIV1RT抑制药有交叉耐药。体内外试验DEL也极易产生耐药变株，临床单药治疗8周，14/15患者之分离株对地拉韦定敏感性降低，仅为原敏感性的1/50～1/500。基因型分析，主要是密码子103及181发生突变［18］。临床分离株，EFV对HIV1RT单个核苷酸取代(密码子48、108、179、及236)株敏感性未变，对A98G、K101E、V106A、Y188C及G190A的敏感性降低10倍，对L100I及K103N的敏感性降低20～70倍，对Y188L、S48T+G190S、K101E+K103N、K101E+L100I及K103N+V181C的敏感性降低80～1000倍。EFV的耐药特征在联合用药的情况下没有改变，与其他NNRTIs有交叉耐药。4蛋白酶抑制药(proteaseinhibitor,PIs)耐药性及耐药机制HIV蛋白酶由99个氨基酸组成，其活性形式为C2对称匀二聚体(相同二个亚单位的聚合体)，属天冬氨酰蛋白酶类。HIV基因组中gag及gag/pol基因各编码一多蛋白前体(p55及p160)，它们均需病毒蛋白酶酶解加工为成熟的结构蛋白和功能蛋白(病毒酶)。如HIV1蛋白酶发生变异或酶活性受到抑制，则生成没有感染性的不成熟的病毒颗粒，说明HIV蛋白酶是病毒复制的必需酶。属于PIs的抗艾滋病毒药物共有9个药物，即沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)、kaletra(洛匹那韦lopinavir,LPV和利托那韦复合制剂)、Atazanavirsulfate(ATV)、福司安普那韦［fosamprenavircalcium(FAV)］及tipranavir(2005/06/22上市)。HIV蛋白酶的单个氨基酸取代，引起低度耐药，需累积多个氨基酸取代，引起高度耐药及交叉耐药［5，19～,21］。耐药突变可发生在蛋白酶活性位置或非活性位置，第一代PIs(SQV、RTV、IDV、NFV)的常见突变为M46L/I/F、I54V、V82A、I84V、L90M。D30N及N88D为NFV特有的变异［22］。V82A及I84V位于蛋白酶活性位置［23］，引起酶活性中心结构改变，造成空间障碍，直接影响药物的结合。M46L/I/F及I54V位于蛋白酶的盖，影响其运动的分子动力学，间接防止药物的攻击。L90M位于蛋白酶非活性位置［24］，影响含有活性位置环的构型，降低底物结合口袋的可塑性及体积，障碍PIs与PR相互作用。这些突变的PR对正常底物亲和力也下降，使病毒复制能力下降。除以上位置突变外，在8、10、20、24、32、33、36、63、64、71、73、77位置也可见到耐药突变。APV至少需累积5个氨基酸取代才引起显着耐药，I50L是APV特有的变异。体内、外均已分离到对LPV耐药的变株，体外在逐步增加LPV浓度下，培养142d，可分离高度耐药变株，具有多处突变(I84V、L10F、M46I、T91S、V32I、I47V、V47A、G16E及H69Y)，IC50增加338倍。此株对利托那韦及沙奎那韦的IC50分别增加22及4倍。临床可根据HIV1分离株突变位置的数目，预测治疗反应率。当突变数为0～5、6～7及8～10时，临床反应率分别为91%、81%及33%。Atazanavir单药治疗50周所分离的耐药株，均有I50L突变，可伴有或不伴有A71V突变，此突变株对其他PIs敏感性增加。但Atazanavir与其他PIs联用时所分离的耐药株表现为交叉耐药的多药耐药，其突变位置为I84V、L90M、A71V/T、N88S/D及M46I。体内、外均已分离到对安普那韦耐药的突变株，其主要突变位置为I50V、V32I、M46I/L、I47V、I54L/M、I84V及P7/P1与P1/P6Gag及GagPol多蛋白前体裂解处。这些突变株在福司安普那韦单药治疗的新患者(未用过抗逆转录病毒药物治疗患者)中也分离到，与其他PIs有交叉耐药。5HIV入胞抑制药耐药性及耐药机制HIV入胞抑制药目前只有一个品种上市，即FuzeonTM(T20，enfuvirtide)。体外可诱导T20耐药变株，基因型突变在gp41的3638残基，突变株对T20敏感性下降5～684倍；临床也分离到T20耐药变株，突变在gp41HR1(Nterminalheptadrepeat,NHR)的3645残基(Q32H/R、G36D/S、I37V、V38A/M、Q39R/H、Q40H、N42T/D/Q/H、N43D/S/K/Q、L44M、L45M、R46M、V69I)，对T20敏感性下降4～422倍［25，26］。在NHR与CHR(Cterminalheptadrepeat)连接处及CHR也可发生突变，位于HR2(CHR)的突变S138A伴发于43突变，使耐药性在原有基础上再增加3倍。V38A/M、N42T/D/Q/H、N43D/S/K/Q呈高度耐药，G36D/S、L44M、L45M的耐药程度较低，部分突变株的复制能力下降。近期报道［27］，有105%未用过T20治疗患者可发生耐药突变，基因多形性(polymorphisms)在HIV非B亚型及重组型发生率比B亚型多。不同取代与亚型有关：N42S发生在亚型A、B、G及C，不发生在亚型F；Q56R发生在亚型A(CRF02AG)；L54M发生在亚型B(CRF14BG)。

2抗乙型肝炎病毒(HBV)药

抗HBV的治疗针对慢性活动性肝炎(CHB)，治疗的近期目的是持续降低病毒载量，ALT正常，改进肝病理及清除HBeAg；远期目的是防止肝炎进展为肝硬化，肝功失代偿及肝癌。当今临床应用的抗HBV药物有干扰素α(IFN)、拉米夫定(lamivudin,3TC)、阿德福韦二吡呋酯(adefovirdipivoxil，ADV)及恩替卡韦(entecavir，ETV，2005年3月上市)，前三药在临床应用较久，表1及表2比较三药疗效。三个化学药的作用靶位均为HBVDNA聚合酶/逆转录酶［28］。

拉米夫定的耐药及耐药机制3TC抑制HBV复制，降低病毒载量效果显着，但易引起耐药。亚洲多中心研究报道，3TC用药1、2、3、4及5年，其耐药发生率分别为15%、38%、55%、67%及69%［29，30］。对HBeAg阴性患者，3TC的耐药发生率更高。因HBV复制率高［31］，每天产生约1011毒粒；由前病毒(前病毒RNA)进行逆转录时，HBVDNAP/RT缺乏功能(proofreading)，无3′5′外切酶，每个复制循环，每个碱基的错配率为10-4；现有药物对核内cccDNA(共价闭环DNA)无抑制作用，cccDNA在感染细胞内存在一定拷贝数，使HBVDNA可持续复制等因素，HBV易发生耐药突变是可想象的。耐药是3TC临床治疗中的重要问题，也是新药开发必需考虑的问题。发生耐药株后，疗效下降，病情反复，原已降低的HBVDNA及ALT又上升，一般上升幅度较低，不超过治疗前水平。发生耐药突变后，继续用3TC治疗，对部分患者仍有疗效，肝病理变化继续改进，但也有41%患者病情加重，尤其在肝移植及HIV/HBV共感染患者可引起进行性肝硬化，肝病理损伤加重，甚至发展为严重肝炎。对已发生耐药突变患者［32～34］，是继续用药或停药或改用其他药物，文献报道结果矛盾，并且不同耐药株复制能力不同，是否继续用3TC治疗，应根据耐药株特征及临床肝病情况(肝功代偿或失代偿)，加以综合考虑，因人而异制定方案(表3)。HBV

DNA聚合酶/逆转录酶可分五个保守的功能亚区［35，36］，耐药突变常发生在HBVDNA聚合酶C基序高度保守区YMDD(酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)内，蛋氨酸被异亮氨酸(YIDD)或缬氨酸(YVDD)取代。最常见的变异为M552I/V及L528M/M552V，其他有L528M/M552I、A529T、V521L、L428V/I、L430M、V521L、A548V等。除前五个耐药突变株在体外研究较多外，其他研究较少，与耐药关联性不够了解。单个氨基酸的取代，就可引起高度耐药，如M552V(即M184V)对3TC的敏感性降低1000倍。3TC出现耐药后，90%患者病毒载量及ALT水平上升，其上升程度低于治疗前水平。各突变株对3TC敏感性不一，其复制能力也不同，如M552I/V任一突变，使突变株复制能力下降；如两者分别合并有L528M突变，可使突变株复制能力恢复。3TC耐药机制有三方面：①YMDD突变可使3TC三磷酸的底物结合口袋构型改变，产生空间障碍，使3TC三磷酸结合能力下降；②3TC耐药株DNAP/RT的催化效率改变，使3TC进入HBVDNA效率降低；③3TC被焦磷酸解或ATP依赖的焦磷酸解将引物末端结合的3TCMP切除增加。V521L(B区)是在阿德福韦二吡呋酯(ADV)进行临床Ⅲ期试验时，对入选患者进行基础基因型分析而发现的3TC突变株，发生率为9%～23%［37］。其不改变野株或耐药株对3TC、喷昔洛韦及ADV的敏感性，但增加病毒复制能力。可能机理有2：其1为使HBVDNA模板再定位，因B区与模板定位有关。其2为影响与酶聚合反应有关的其他残基，V521位于接近催化中心的DNA模板下面，是一补偿性突变。由于其增加病毒复制效率，如患者发生此取代，不能再用3TC治疗。对A529T在体外进行研究时，发现其复制依赖3TC，但A529T突变使与pol基因重叠的外膜基因(S基因)产生一终止密码，使HBsAg及病毒分泌障碍。含有此突变患者，血清HBVDNA不上升，也不发生进行性肝炎加重。如发生其它依赖3TC复制的突变株，需停用3TC。由上所述可归纳几点：①基因型突变不一定同时伴有表型改变；②每一突变株，不论是单点突变或多处取代，该突变株需在体外进行特征研究，包括对药物敏感性、复制能力、复制是否依赖诱导突变的药物及对酶分子结构影响的机理等；③临床观察耐药是否与此突变有关。可见，每一突变株的研究是很复杂的。对HBV感染进行肝移植患者，术后一般用3TC或3TC+HBIg治疗，以预防HBV复发。HBIg诱导的耐药突变，常发生在HBVDNAP/RT的AB间区。大规模HBV疫苗接种也可诱导突变株，逃避疫苗的保护作用。如台湾于1984年开始大规模HBV疫苗接种，10年后发现在HBV慢性携带者体内HBV逃逸变株由8%上升到28%。这两种突变株对3TC均敏感，长期应用3TC治疗，在原变异的基础上可再诱发3TC耐药突变，使治疗失败。3TC耐药株与其它抗HBVL型核苷衍生物(FTC、telbivudine)及泛昔洛韦、恩替卡韦(恩替卡韦高剂量可克服交叉耐药)有交叉耐药。

表1HBeAg阳性的CHB对抗病毒治疗反应

表2HBeAg阴性的CHB对抗病毒治疗反应

*IFN及3TC：分子杂交；ADV：PCR；NA：未测定。

表3治疗CHB的建议

*HBVDNA105拷贝/ml；#DDW04：2004年美国消化道疾病周国际会议［28］。

阿德福韦二吡呋酯的耐药及耐药机制［38，39］ADV为核苷酸衍生物，临床应用中不易产生耐药突变，用药1年、2年、3年及4年的耐药突变率分别为0%、2%、5%～6%及18%。近期报道124例HBV患者接受ADV治疗96周，在2例患者发现N584T(即N236T，D区)突变，体外该突变株对ADV敏感性下降10倍。计算机分子模型研究，N584T失去两个氢键，使静电作用显着下降，影响了ADV的结合效率。ADV耐药变株对3TC、FTC、telbivudine及恩替卡韦仍敏感。计算机分子模型研究，ADV对典型3TC耐药株(L180M、M204V/I、L180MM204V/I)敏感性上升的原因为增加了范德华引力，并对天然底物的亲合力下降。

恩替卡韦的耐药及耐药机制［40］ETV为核苷衍生物，对HBV野株及3TC耐药株具有很强的抑制作用(表4)［33］，临床长期应用对3TC耐药患者疗效明显，并且不易产生耐药突变。Tenney［40］报道恩替卡韦Ⅱ期临床试验中，有2例患者发生病毒反跳，出现耐药突变。患者A用3TC治疗54周后，用ETV05mg治疗52周，继用ETV及3TC100mg治疗89周，病毒反跳发生在ETV开始用药后的133周。耐药株基因分析，在原3TC耐药突变的基础上(V173L/L180M/M204V)又增加两个突变(I169T及M250V)，体外研究对ETV敏感性降低除原3TC耐药突变外，还需M250V取代。患者B为肝移植病人，用ETV前，曾用过泛昔洛韦、更昔洛韦、磷甲酸钠及3TC，均治疗失败。耐药株有多处突变(S78T/V173L/L180M/T184S/M204V)。病毒反跳发生在用10mgETV76周后。耐药株基因分析，在原耐药突变基础上，又增加三个突变(T184G/I169T/S202I)。体外分析，当T184G及S202I与3TC耐药突变共存时，对ETV敏感性降低最多。因此，ETV长期用药，若在3TC耐药突变的基础上，加上ETV特有的耐药突变，可使治疗失败。

表4抗HBV药物对HBV野株及3TC耐药株的IC50及在10μmol/L浓度下的复制能力

LD4FC：2′3′二脱氧2′3′二脱氢βL5氟胞啶核苷；LFMAU：2′氟5甲基βL阿糖尿嘧啶；DDAPD：二氧戊环鸟苷前药。

3抗流感病毒药

抗流感病毒药的作用靶点［41］临床应用的抗流感病毒药有金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦及奥塞米韦4个品种。金刚烷胺及金刚乙胺上市较早，两者只抑制流感病毒甲型。金刚烷胺对流感病毒M2蛋白离子通道的作用与其抗病毒作用机制有关。两者作用机理相同，均为笼状化合物，作用于病毒四聚体穿膜蛋白M2离子通道，阻碍H+离子由酸化的内体通过M2离子通道进入毒粒内部，不能降低毒粒内部pH,从而不能诱导酸依赖的HA构型改变，阻碍病毒外膜与内体膜(浆膜)融合，使病毒基因组复合体不能进入胞浆。两者作用于病毒吸附后到病毒外膜与内体膜融合这一时间段。扎那米韦及奥塞米韦(达菲)为1999年上市新药，两者为流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase，NA)慢结合抑制剂，对甲、乙型流感病毒均有抑制活性。扎那米韦及奥塞米韦也是利用计算机辅助设计成功开发的典范。近年由于禽流感(H5N1)的暴发，WHO一再警告流感的大流行。据报道奥塞米韦在临床上对禽流感患者有效，与禽流感病毒接触过的人只要在48h内服用奥塞米韦，可不出现禽流感症状。发达国家都在增加奥塞米韦的库存，英国及法国均订购了供1500万人份使用的药量，美国也订购了供230万人份使用的药量。

金刚烷胺的耐药及耐药机制［42］体内、外流感甲型病毒对金刚烷胺均易产生耐药，耐药与编码M2蛋白基因的单个核苷酸突变有关，与抗性有关的突变主要发生在位于跨膜域α螺旋区的26、27、30、31及34位氨基酸，以31位突变最常见，该区域为金刚烷胺类药物作用靶点。突变株的毒力不降低，仍可在人群中引起感染，约30%的成人及儿童在治疗的d5～7天可分离耐药株，耐药株对扎那米韦、奥塞米韦及利巴韦林仍敏感。

扎那米韦及奥塞米韦的耐药及耐药机制［43，44］神经氨酸酶广泛存在动物及微生物中，是一种苷水解酶，可将细胞表面以苷键连接在糖蛋白和糖脂上的唾液酸水解，在微生物的感染和传播中发挥重要作用。流感病毒神经氨酸酶是病毒复制的关键酶，破坏细胞表面病毒血凝素(HA)受体，协助子代毒粒由感染细胞表面释放，防止毒粒聚集，促使毒粒通过呼吸道黏液，有利于其在呼吸道黏膜扩散。体外及临床均发现病毒神经氨酸酶的耐药变异毒株(表5)，扎那米韦治疗的正常患者未分离到耐药株。奥塞米韦治疗患者，1%成人患者及5%儿童患者可分离到耐药株，儿童患者易产生耐药突变，用药d4即可分离到耐药株

。耐药变异毒株的复制能力下降，对小鼠及雪貂的毒力、致病性扎那米韦及传染性均较野株弱，其临床意义不明。耐药取代特征与病毒型有关。对His274Tyr分子耐药机制研究，发现His274Tyr及His274Phe变株NA对奥塞米韦敏感性降低是因取代氨基酸的侧链大，影响Glu276的再定位(奥塞米韦结合需Glu276再定位reorientation)。如以侧链较小的Gly、Asn、Ser及Gln取代，则对奥塞米韦敏感性增加或不改变，但对扎那米韦敏感性降低。流感病毒A/Tokyo/3/67(H3N2)的His274Tyr取代，不影响对奥塞米韦及扎那米韦的敏感性。说明274位氨基酸侧链的体积影响流感N1NA对奥塞米韦及扎那米韦的敏感性，但不影响N2NA对奥塞米韦及扎那米韦的敏感性。

表5

4抗疱疹病毒(HSV)药

抗疱疹病毒药的作用靶点临床应用的抗疱疹病毒药有近20个品种，绝大部分为核苷或核苷酸衍生物，作用靶点为HSV编码的DNA聚合酶(DNAP)，作为酶天然底物的竞争性抑制剂，抑制酶活性，阻碍病毒DNA合成，并终止病毒DNA链的延长。它们均需在细胞内转化为活性三磷酸或二磷酸衍生物，才能发挥抑制HSVDNAP作用。第一步磷酸化是限速因子，与HSV编码的胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinekinase,TK)有关。

阿昔洛韦(ACV)的耐药及耐药机制［45］阿昔洛韦(aciclovir，ACV)于20世纪80年代初上市，由于其高效低毒，被誉为抗病毒药物发展史的里程碑，直到目前阿昔洛韦仍为抗单纯疱疹病毒首选药物。ACV是一开环核苷，其活性化合物为阿昔洛韦三磷酸。阿昔洛韦第一步磷酸化依赖单纯疱疹病毒基因编码的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)，该酶只存在于单纯疱疹病毒感染的细胞内，正常细胞内无此酶。因此只有在感染的细胞内阿昔洛韦才能进行关键的第一步磷酸化，生成阿昔洛韦一磷酸，以后在细胞核苷酸激酶的催化下，相继生成阿昔洛韦二磷酸及阿昔洛韦三磷酸，后者发挥抗病毒DNAP作用。免疫功能正常患者发生ACV耐药突变很少(1%)，免疫功能降低患者发生ACV耐药突变率为35%～86%，尤其是骨髓移植患者高达14%。耐药突变与TK及DNAP的基因突变密切相关，其机制有3种：①TK缺失突变，病毒不能表达TK；②TK底物特异性改变；③DNAP活性改变。95%ACV耐药株为TK缺失表型，对动物致病力降低。TK为UL23基因编码，含376个氨基酸，有6个保守区(5066、7991、162178、212226及281292)。1/2耐药株为核苷酸的插入或缺失，另一半为取代，后者常发生在HSV1的176位及336位，HSV2的177位。DNAP为UL30基因编码，含1235个氨基酸，有8个保守区，40%的突变发生在Ⅱ区及Ⅲ区。

5如何预防耐药突变

(1)患者用药的依从性患者用药依从性对预防耐药突变非常重要，防止不规则用药或任意中断用药。BritishColumbiaCenter观察1200例HIV患者耐药发展情况，发现服药依从性是是否产生耐药的最强因素。(2)采取最佳联合用药方案及剂量，以降低或延缓发生耐药。(3)治疗前了解感染毒株对药物敏感性。(4)用药早期，监测病毒载量，观察患者对治疗反应，及时调整治疗方案。

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