传染病病原体诊断-

传染病病原体的诊断技术传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第1页。FriendorFoe?RotavirusEbolavirusBacteriumAlgaeProtozoanVirus传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第2页。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第3页。1973年以来部分新发的传染病1973轮状病毒婴儿腹泻的主要病因

1975细小病毒8195号病，慢性溶血性贫血的再障危象

1976隐孢子虫隐孢子虫病，急性小肠结肠炎

1977埃博拉病毒埃博拉出血热

1977嗜肺军团菌军团病

1977汉坦病毒肾综合征出血热

1977空肠弯曲杆菌空肠弯曲菌肠炎

1977丁型肝炎病毒丁型肝炎

1980嗜人T细胞病毒I型T细胞淋巴瘤／白血病

1981金黄色葡萄球菌产毒株中毒性休克综合征

1982大肠埃希菌O157：H7出血性结肠炎

1982嗜人T细胞病毒11型毛细胞白血病

1982伯氏疏螺旋体莱姆病

1983人类免疫缺陷病毒艾滋病(HIV)传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第4页。1973年以来部分新发的传染病(续)1983幽门螺杆菌消化性溃疡病1986环孢子球虫环型孢子虫病(顽固性腹泻)1988人疱疹病毒6型突发性玫瑰疹1989丙型肝炎病毒丙型肝炎1990戊型肝炎病毒戊型肝炎19920139霍乱弧菌O139霍乱1992巴尔道氏体猫抓病，杆菌性血管瘤病1993汉坦病毒分离株汉坦病毒肺综合征1994Sabia病毒巴西出血热1994新变异型克雅氏病(人类疯牛病)1985年疯牛病（牛海绵状脑炎BSE）

--1994年出现首例nvCJD--2019年提出nvCJD概念病原为朊蛋白PrP（英）2019庚型肝炎病毒庚型肝炎2019H5N1禽流感病毒人禽流感2019Nipah病毒尼巴病毒性脑炎2019西尼罗病毒西尼罗病毒性脑炎2000裂谷热(RiftValley)病毒裂谷热2019SARS冠状病毒SARS（传染性非典型肺炎）传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第5页。大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正肆虐全球的禽流感。每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。前所未有的速度产生突变，并传给人类，就如艾滋病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流感等难抗病毒。研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。新发传染病－－动物传播传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第6页。与人类行为及环境的改变有关过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类，其中四分三为源自动物的疾病，包括艾滋病、马尔堡出血热、SARS及禽流感等。丛林打猎、密集耕种、全球变暖及长途旅行的普及，增加疾病跨种物传播的机会，使动物身体上的病原体容易产生突变，感染人类。一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上发现的一种病毒，其后传播至人类身上，更演变成世纪绝症。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第7页。新病原体的特征现时人类新传染病的病原体，多属于核糖核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短时间内发生突变，并容易适应新宿主，令跨种物传播机会变得更大。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第8页。人类与传染病较量中的四方面重大突破隔离检疫制度的建立;病原微生物的发现;特效药物的出现;疫苗的诞生.传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第9页。快速诊断是关键在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。其中，及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据。及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预警，这是现代传染病防治体系的最前沿

对已知传染病要尽快明确诊断对未知新发传染病要查病因

传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第10页。传染病的实验室诊断一般检查;生化检查;病原学检查;免疫学检查;病理组织检查;影像学检查.传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第11页。传统的和常规的病原学诊断分离培养(细胞,组织动物);显微镜检查(光学和电子显微镜);抗原成分检测(ELISA,免疫荧光等);分子生物学基因诊断(核酸杂交,PCR等);传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第12页。ElectronmicrographsAdenovirusRotavirus(courtesyofLindaStannard,UniversityofCapeTown,S.A.)传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第13页。免疫荧光检测Positiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC)(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital)传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第14页。细胞病变效应(cpe)Someviruseskillthecellsinwhichtheyreplicate,ofteneasilyvisibleascpe,othervirusesproducelittleornocpeTypicallyroundingordetachingofcellsandcellfusion(syncytia)FromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpressFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第15页。实验动物Laboratoryanimals-animalmodelsofhumaninfection.Historicallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoanimal.Problems-1)inconvenientandexpensive,2)notadefinedsystem-leadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfareissues,Advantages-1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)givesuniqueinsightintoviruspathogenesisEmbryonatedeggsFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第16页。核酸诊断的发展史核酸分子杂交聚合酶链反应（PCR）核酸定量分析核酸的直接检测核酸扩增检测(PCR)定性PCR定量PCR传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第17页。核酸分子杂交(nucleicacidmoleculahybridization)genomeprobe32P35S3H125I生物素地高辛酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe检测方法：放射自显影底物显色化学发光传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第18页。常用核酸分子杂交技术斑点杂交（spotblothybridization)凝胶电泳印迹转移杂交（Southernblothybridization)原位杂交（in-situhybridization)传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第19页。聚合酶链反应（PCR）基本步骤和原理变性（高温）退火（低温）延伸（适温）每一循环模板引物引物dATPdGTPdTTPdCTPTaq酶传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第20页。PCR原理和步骤传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第21页。定量PCR

---荧光实时定量PCRTaqman水解探针法杂交双探针法分子信标（环性探针）法

Amplisensor能量转换法等传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第22页。新发传染病的病原体？？？传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第23页。病原学发现的“科赫三定律”一、每种传染病必定能发现其病原体；二、能培养出该病原体的纯种；三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以产生相同的病变。

传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第24页。

建立该病原体的鉴定方法动物试验临床实验室诊断流行病学研究等分离到该病原体确定一种疾病病原体的基本步骤最终确定病原体与疾病的病因学关系传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第25页。基本思路回答两个问题：是否是已知的病原体或其变种？是否是完全未知的一种病原体？基本要求：快、准传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第26页。已知病原体的快速诊断高通量的检测技术传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第27页。高通量的病原体筛选技术病原体核酸的高通量检测技术一：多重PCR（联用技术：质谱技术、液相芯片技术）技术二：病原体基因芯片病原体抗原或抗体的高通量检测核心技术：蛋白质芯片传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第28页。MultiplexPCR-MassTagsystem多重PCR-质谱联用技术传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第29页。美国哥伦比亚大学Lipkin研究组发明了一种基于multiplexPCR-MassTag（多重PCR与质谱联用）的高通量病原体快速筛选技术。优点：由于使用光敏感的分子量标签，增强了multiplexPCR引物设计的适应性和灵活性，使检测通量有大幅度的提高。应用质谱分析PCR产物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限或荧光染料种类的局限。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第30页。1.PCRamplificationwithconjugatedprimers90minutesBA2.PCRpurificationonfilterplate30minutes3.Elutioninto96-wellloadingplateformassspectrometeranalysis96-wellthermocyclerplateBA4.Automatedsampleinjection,photocleavageanddetection1:30minutes/samplePurifiedsamplesUltravioletLightCleavageofmasstagsfromampliconMSBABABABABABAIonizationanddetectionABABMassSizeAbundance5.IdentificationofpathogenbysignalanalysisPCR-MassTagsystem传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第31页。NUCLEICACIDCONJUGATEDMASSTAGSPhotocleavablelinkerandspacerMSsensitivityenhancerVariablemassunit

传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第32页。DETECTIONOF58DIFFERENTMASSTAGSBYAPCI-MS传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第33页。目前，建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模块（包括19个病毒和3种细菌），流感病毒亚型检测模块，出血热病原体检测模块，痘疹病毒检测模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块。尽管目前已开发的分子量标签只有64个，但根据质谱分析的分子量范围，还可有极大的拓展空间，保证了这一技术具有足够的发展前景和潜力。应用传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第34页。RESPIRATORYSYNDROMEPANELInfluenzaAMatrixInfluenzaAN1InfluenzaAN2InfluenzaAH1InfluenzaAH2InfluenzaAH3InfluenzaAH5InfluenzaBHARSVGroupARSVGroupBMetapneumovirusEuropeanstrainsAmericanstrainsCoV-SARSCoV-OC43CoV-229EHPIV-1HPIV-2HPIV-3HPIV-4HPIV-4aHPIV-4bChlamydiapneumoniaeMycoplasmapneumoniaeLegionellapneumophilaStreptococcuspneumoniaeHaemophilusinfluenzaeInfluenzaAH7RhinovirusHerpesSimplexVirus1,2VaricellaZosterVirusCytomegalovirusHIV-1HIV-2MeaslesvirusMycobacteriumtuberculosisPneumocystiscariniiCoxiellaburnettiCurrent

Respiratory

PanelIn

ProgressEnterovirusAdenovirus传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第35页。HEMORRHAGICFEVERPANELEbolavirus(Zaire)Ebolavirus(Sudan)MarburgvirusCrimean-CongohemorrhagicfevervirusRiftValleyvirusHantaanvirusSeoulvirusYellowFeverKyasanurForestvirusLassavirus (lineageIV)Ebolavirus(Reston)JuninvirusMachupovirusDobravavirusTacaribevirusGuanaritovirusSabiavirusLCMVChikungunyavirus

DenguevirusgroupBorreliaburgdorferiHerpesSimplexvirus(1,2)HIV-1,-2NeisseriameningitidisRickettsiaSpottedFeverGroupPlasmodiumspCurrentPanelIn

Progress传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第36页。ACBLabNetworkEpidemiologyMicrobiologyresearchservicetraining

infectiousagentssamplesclinicaldataGLOBALSURVEILLANCENETWORKAnimalmodelsdrugsvaccinesDrosten,HamburgLipkin,NewYorkMackenzie,PerthPauli,BerlinPeiris,HongKongQian,BeijingPerez-Brena,MadridSwanepoel,SouthAfricaWebster,MemphisWen,Shanghai传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第37页。MultiplexPCR-XMAP多重PCR-液芯联用技术传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第38页。DiagramLUMINEXXMAP技术：多指标并行检测系统（流式荧光技术或液芯技术）技术GENOCATemplex™PCR技术:多指标并行扩增传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第39页。SuperPrimerTemplex™PCR技术原理传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第40页。Templex™PCR技术原理传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第41页。巢示PCR引物提高了引物间的相容性低浓度的特异性引物降低了反应过程中的背景值.仅有的一条生物素标记的引物使得更容易扩大生产以及质量控制.传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第42页。流式荧光技术（液芯）原理——XMAP荧光编码微球技术传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第43页。每种微球的地址由两种红色荧光颜料的掺入比例唯一决定颜色编码的微球传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第44页。共价交联技术CONH传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第45页。反应模式传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第46页。MultiplexAssayswithColorSeparetion传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第47页。Luminex100多功能流式点阵仪流式荧光检测仪传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第48页。

呼吸道感染Ⅰ型

11种DNA基因组的病原体传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第49页。呼吸道感染Ⅱ型

13种RNA基因组病毒型病原体传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第50页。蛋白质芯片MASATM液相芯片传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第51页。一.基本原理微小的乳胶颗粒（Beads,微球）分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白（如抗原抗体）以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物（被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等）。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第52页。固定生物分子的微球传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第53页。悬浮点阵多分析物组合灵活传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第54页。TheRedLaserisUsedtoIdentifytheBeadCodeTheGreenLaserisUsedtoIdentifytheReporterSignal传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第55页。

液相芯片的特点：

液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点：

1.重复性好

2.通量大

可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第56页。

3.灵活性好

4.灵敏度高

5.信噪比好

6.操作简便，不需洗涤，耗时短

7.液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应

传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第57页。HybridizationTime%ofMaximumMinutes传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第58页。

MASATM和ELISA灵敏度的比较传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第59页。基因芯片（GeneChip）

何谓基因芯片：基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500µm）排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。基因芯片的种类：

按应用，基因芯片主要可分为3类：1、表达谱基因芯片：主要用于基因功能研究；2、诊断基因芯片：如肝癌诊断芯片、糖尿病诊断芯片、病原体多基因诊断芯片等：3、检测芯片：如商品检疫芯片、病原体检测芯片等。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第60页。ViralPathogenCustomMicroarray病原体诊断基因芯片传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第61页。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第62页。HighSensitivityScanner0.05CPSMCPSM-whatdoesitmean?Chromphorespersquaremicron0.05cpsmor5moleculesofdyeper10micronpixel.Competitorsbestis10moleculesofdyeper10micronpixel.Toachievehighsensitivity:DynamicAutofocusLaserstabilityControlHighresolutionscanning0.05CPSMDetect5dyemolecules

in10umpixel

0.1CPSMDetect10dyemolecules

in10umpixel传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第63页。eArray

DeliveringCustomContentandFormatsBackNameYourDesignSelectArrayFormat传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第64页。ProkaryoticArrayCustomDesignsAgrobacteriumAnopheles(AG)andPlasmodium(PB)...ie.malariamicroarrayArchaeon,Halobacteriumsp.BacilluscereusBacterialpathogensBifidobacteriumlongumBordetellaPertussisChlamydophilaabortusCulexpipiensCyanobacteriumSynechocystisE.ColiErwiniacarotovoraatroseptica/SolanumtuberosumLactobacillusplantarumMethylobacteriumextorquensAM1PlasmodiumfalciparumPseudomonasaeruginosaS.aureus;N.meningococcus;E.coliSalmonellatyphimuriumStaphylococcusaureus传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第65页。SARSCoronavirus传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第66页。HumanCoronavirusOC43传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第67页。HumanCoronavirus229E传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第68页。GreeneChip1.1CATCTGGTGTGGAAGCCTTATCGGAACAAGGACCAGAGCCACCTGGGCTGAGAACATCTASample:WNVNY99100,000RNAcopies/ml32/45tophitsareWNV-specific;remainderareJEVgrouporotherflavivirus-genusprobesCollaborationbetweentheGreeneLaboratoryofColumbiaUniversity,ICTV,NortheastBiodefenseCenter,andAgilentCorporation传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第69页。CATCTGGTGTGGAAGCCTTATCGGAACAAGGACCAGAGCCACCTGGGCTGAGAACATCTASample:SARS-CoV100,000RNAcopies/mlGreeneChip1.1Columbia(Briese,Lipkin,Liu,LussierPalacios),ICTV(Büchen-Osmond),andAgilent(Hirschberg)251,000sequencedatabase,1710vertebrateviruses传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第70页。未知新病原体的发现传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第71页。发现新病毒的主要技术路线表达cDNA文库筛选技术宽范围PCR（基于保守序列的PCR）差异显示技术：代表性差异分析（RDA）抑制性消减杂交（SSH）序列非依赖的扩增：随机PCR（randomePCR）序列非依赖的单引物扩增（SISPA）传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第72页。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第73页。cDNA文库筛选cDNA文库筛选常被用来检出RNA病毒的核酸。收集病毒颗粒（感染组织匀浆过滤，或者血浆超速离心以收集病毒颗粒），提取RNA，逆转录成cDNA,构成cDNA表达文库。最常用的表达型载体是λgt11,插入的cDNA片断可以融合蛋白形式表达，保留抗原性。病毒在感染过程刺激机体产生特异性抗体，因而常用患者恢复期的血清对cDNA库进行免疫学筛选。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第74页。HCV的发现

1989年Choo等小组从被感染的黑猩猩的血浆中用超离心的方法收集病毒颗粒，提取核酸（包括RNA和DNA），充分变性后逆转录cDNA，构建λgt11cDNA表达文库。用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库，结果得到一个反应性克隆。该cDNA克隆与正常人的DNA不杂交，说明他来源于外源基因组。与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交，与未感染黑猩猩的肝组织RNA不杂交，提示该因子可能就是输血相关肝炎的一种致病因子。发现该cDNA克隆仅与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交，而与DNA不杂交，提示该因子是一种RNA病毒。序列分析表明属于黄病毒科，命名为HCV。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第75页。基于保守序列的聚合酶链式反应

（ConsensusSequenceBasedPCR）基本原理：基于保守序列的聚合酶链式反应（以下简称保守序列PCR）就是通过已知的一种生物和另一种生物之间高度保守的DNA序列设计引物，用PCR的方法去扩增另一种生物的未知DNA序列。当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒相似时，可以根据已知病毒的保守序列设计引物，然后用PCR方法扩增出未知病毒的相应序列。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第76页。新型汉坦病毒的发现

1993年5月，在美国西南部爆发了一场高死亡率的急性呼吸道疾病。血清学试验中发现。病人的血清能与一些已知的汉坦病毒抗原起交叉反应，提示该病的病原体有可能是一种以前未能发现的新汉坦病毒。1993年Nichol等根据已知的汉坦病毒基因组M片断的包膜糖蛋白G2编码区的保守部位设计了PCR引物，扩增出一个278bp的DNA片断。序列分析表明，与其他个血清型的汉坦病毒至少有30%的不同源性，在系统发生上与IV型希望山病毒（ProspectHillvirus,PH）最为接近，说明该病毒是一种新的汉坦病毒。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第77页。基于保守序列的PCR技术要点---引物设计一种是简并PCR，其所用的是一个混合的引物库，包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所有可能的核苷酸序列（设计引物之前，列出该病毒家族所有成员的对比图），但简并度很高时有效引物的浓度不足。另一种是根据密码子的偏向性设计单一的引物：依照高度保守的氨基酸序列，选择每个氨基酸最常用的密码子组成一条完整的引物。适用于分离亲缘关系较近的相关序列，但对亲缘关系较远的序列则不能检出。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第78页。简并引物设计目前已经可以有计算机软件来设计，常用的软件有:

PrimoDegenerate3.4GenefisherCODEHOPSimpledegenerateprimer(U:Oregon)

传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第79页。差异显示技术

（differentialdisplay)最先是Liang和Pardee等提出用于比较两种细胞或同种细胞在不同状态下mRNA表达差异的技术;现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达基因的技术，其中代表性差异技术(RDA)和抑制消减杂交技术(SSH)以其灵敏度高、假阳性率低和重复性好而相对更受欢迎传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第80页。代表性差异分析

（RepresentationalDifferenceAnalysis,RDA）基本原理：病原微生物感染靶器官或组织时，同时带入自己的基因组，这样病理组织就比正常组织多出了病原体基因组。RDA可以把单拷贝的外源基因组从高度复杂的人染色体DNA本底中检测出来。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第81页。RDA流程分别提取实验组(Tester)和对照组(Driver或驱动子)的总RNA或者DNA用四碱基内切酶充分酶切，分别连上寡核苷酸接头，并用特异性的接头引物扩增扩增产物去除接头，再在实验组扩增子上连上新接头，将两份扩增子杂交，以新接头为引物进行扩增只有那些未能与驱动扩增子杂交而自身退火的样品DNA的两端因都能与引物配对才以指数形式扩增，而待检样品单链DNA和驱动样品DNA只有一端与引物配对而线性扩增传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第82页。GBV病毒的发现GB肝炎是Deinhardt等在1970年首先报道。后研究表明GB肝炎因子不同于甲-戊型肝炎病毒。2019年Simons等用GB肝炎因子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血浆，分别提取总RNA，逆转录成cDNA作RDA分析，7个cDNA克隆序列分析表明，属于两种黄病毒，与HCV有一定同源性命名为GBV-A和GBV-B。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第83页。RDA的缺点其本身不能消除不同mRNA分子丰度的差异,因而往往需要进行多轮杂交而每轮杂交都涉及到接头的连接和去除效率问题以及绿豆核酸酶消化去除单链等操作传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第84页。抑制性消减杂交技术（SSH）2019年Diatchenko等将抑制性PCR和减法杂交结合起来，创立了SSH技术。该技术通过接头特异性的引物选择性地扩增差异表达基因片段的同时，可以抑制非靶片段的扩增。利用杂交二级动力学原理巧妙地在减法杂交过程中消除了不同mRNA分子间丰度的差异，因而通过一次减法杂交可将差异片段富集1000倍以上。一般只需两轮杂交，3-4天即可得到几十或上百个差异片段传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第85页。SSH的基本步骤传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第86页。RDA与SSH原理相似：都是建立在PCR技术和减法杂交的基础上。RDA是先对样品的cDNA进行扩增再杂交，而SSH则是先减法杂交再扩增。两者都具有高效、重复性好、阳性率高等优点。共同的缺点：由于驱赶子和待检测的标本的背景往往不完全相同，富集的差异片段可能不是微生物学鉴别的有用标记。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第87页。最新的技术序列非依赖的扩增法：随机PCR(randomPCR)技术序列非依赖的单引物扩增(SISPA:sequenceindependentsingleprimeramplification）传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第88页。RandomPCR基本原理：在合成随机引物时在其加上一个相同的接头，这个接头含有一个限制性的酶切位点可以便于随后的片断克隆进载体，然后对插入序列测序并进行BLAST比对即可初步获得未知病毒的种系来源信息。这种随机PCR法不仅可以检出DNA病毒也可以检出RNA病毒。利用这种方法Allander等在2019年在呼吸道感染的标本中发现了一种人的parvovirus；StangA等也在2019年使用这种方法在慢性疲劳综合症的病人漱口液中意外检测出了HSV-1型病毒。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第89页。SISPASISPA是单引物扩增法中最常用的一种方法，用于鉴定低浓度的未知序列的病毒核酸。基本原理：对基因组DNA常用识别四个碱基的酶先切割，然后在双链核酸片段的两端连接上一个相同序列的接头（adaptor），这个接头可作为随后PCR反应的引物，进行单引物扩增。通过将这些产物克隆即可进行测序。SISPA有很多的衍生方法，主要是通过对引物进行修饰如引入酶切位点、单链接头或者平头、粘性末端；或者是未知的病原的核酸通过不同的酶进行切割，所得片断的两端引入不同的接头以提高扩增的特异性。SISPA的检测低限是106个拷贝/ml，而它的灵敏度取决于临床标本的种类以及未知病毒的属性。传染病病原体诊断-全文共100页，当前为第90页。RDA和SISPA随机PCR方法和SISPA是未知病毒检测中操作相对比较简单的方法，通过序列非依赖的扩增即可扩增出大量的病毒基因片段，但实际操作过程中会有很多的假阳性，主要是因为接头或随机引物的可以非特异性结合试剂中存在的一些核