哺乳动物胚胎干细胞技术

哺乳动物胚胎干细胞技术第一页，共六十六页，编辑于2023年，星期五主要内容一、胚胎干细胞的生物学特点二、胚胎干细胞研究的意义三、胚胎干细胞研究的历史与进展四.胚胎干细胞的分离培养基本程序五.ES细胞的保存六.ES细胞的鉴定七.ES细胞技术目前存在的问题八.ES细胞技术的发展方向第二页，共六十六页，编辑于2023年，星期五干细胞功能组织发生全能干细胞多能干细胞专能干细胞胚胎干细胞组织干细胞干细胞分类第三页，共六十六页，编辑于2023年，星期五全能干细胞Totipotentstemcells

具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如胚胎干细胞。八细胞阶段第四页，共六十六页，编辑于2023年，星期五多能干细胞Multipotentstemcells

具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。

骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。第五页，共六十六页，编辑于2023年，星期五专能干细胞

多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一类型的细胞。又称单能干细胞。如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。第六页，共六十六页，编辑于2023年，星期五胚胎性干细胞Embryonicstem(ES)Cells

来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞(Multipotentstemcells)。第七页，共六十六页，编辑于2023年，星期五组织干细胞Tissue-specificstemcell

指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(Adultstemcells)。第八页，共六十六页，编辑于2023年，星期五一、胚胎干细胞的生物学特点1.定义哺乳动物胚胎干细胞（EmbryoDerivedStemCells）又称ES或EK细胞，是从早期胚胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面具有分化潜能。第九页，共六十六页，编辑于2023年，星期五第十页，共六十六页，编辑于2023年，星期五2.来源：囊胚的内细胞团（ICM）早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着囊胚腔的内层生长，最后发育为卵黄膜；ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，肝脏，胰脏）外表感神仙（外胚层发育为表皮，感觉，神经系）其余的是中胚层第十一页，共六十六页，编辑于2023年，星期五第十二页，共六十六页，编辑于2023年，星期五3.细胞学特点具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但是细胞核较大，核质比高，核仁较大，培育时呈克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行人为定向分化。普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分化，能进行冷冻保存和遗传改造。发育全能性：第十三页，共六十六页，编辑于2023年，星期五1）形成畸胎瘤：将ES细胞接种同源动物皮下可形成内、中、外三种胚层细胞。2）形成类胚体：将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种系混杂的集合体ES细胞全能性体现在：第十四页，共六十六页，编辑于2023年，星期五3）直系分化：通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。4）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。ES细胞或EG细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚胎发育，形成嵌合体。第十五页，共六十六页，编辑于2023年，星期五4.功能在滋养层细胞上或在含有分化移植因子的介质中，能维持未分化状态，并实现自我更新，因此可以无限增殖；在体外，在诱导因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。第十六页，共六十六页，编辑于2023年，星期五ES细胞具有种系传递（germlinetransmission）能力，能够形成嵌合体动物（chimericanimal）。

若在体外把ES细胞注射至另一胚泡内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric）。ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。通过交配可以分离出带有ES细胞遗传性状的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种证明。第十七页，共六十六页，编辑于2023年，星期五5、ES细胞自我更新的分子机理1、LIF（白血病抑制因子）:ES细胞表面的有一复合受体，由低亲和性的LIF受体和普通亚基gp130构成异源二聚体，LIF与受体结合后激活Jak酶，通过对STAT3的磷酸化激活维持细胞自我更新的基因。第十八页，共六十六页，编辑于2023年，星期五（2）转录调控因子oct-4：oct-4是ES细胞维持多能性和进入分化的开关，是DNA特异结合蛋白，通过激活或者移植靶基因的转录活性，维持ES细胞的自我更新。在ES细胞中始终保持一定的水平，表达量在50~150%，才能实现自我更新和维持多能性。NiWa等（2000）研究表明：STAT3和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互协调维持ES细胞的功能。第十九页，共六十六页，编辑于2023年，星期五（3）通过移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和细胞外调节激酶ERK，维持ES的正常功能：SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基团，作用于gp130受体的胞内区，使gp130和其他的膜受体收到刺激后ERK被激活。SHP-2和ERK对STAT3功能有负调控作用，抑制其信号传导。第二十页，共六十六页，编辑于2023年，星期五二、胚胎干细胞研究的意义1.ES细胞是研究哺乳动物个体发生发育规律极有价值的工具第二十一页，共六十六页，编辑于2023年，星期五2.是研究细胞分化的理想手段ES细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病抑制因子或白细胞介素-6家族的培养液中维持不分化状态，当培养液中添加分化诱导剂时可以出现定向分化，如视黄酸诱导分化为神经元和神经胶质细胞，DMSO诱导分化为平滑肌细胞等。通过研究ES细胞的分化特点，可揭示细胞内信号转导的路径，发现新的信号受体，揭示细胞分化和调亡的机理。第二十二页，共六十六页，编辑于2023年，星期五第二十三页，共六十六页，编辑于2023年，星期五3.研究基因功能的首选细胞由于ES细胞具有稳定的核型，并易于诱捕外源基因，因此进行基因敲除或定向插入外源基因的理想细胞。用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或用细胞核移植技术获得的克隆后代，通过观察后代的表型变化，可探明未知基因的生物学功能和表达调控规律。第二十四页，共六十六页，编辑于2023年，星期五4.是生产转基因动物的主要方法之一用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得嵌合体后代，用转染的ES细胞分化为生殖干细胞，生产转基因阳性动物。也可把转化后的ES细胞作为供体核，用细胞核移植技术直接获得转基因动物。第二十五页，共六十六页，编辑于2023年，星期五第二十六页，共六十六页，编辑于2023年，星期五5.ES细胞治疗技术将引起一场医学革命第二十七页，共六十六页，编辑于2023年，星期五人类面临的大多数医学难题,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、癌症、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病组织工程学、功能基因组学和蛋白质组学、发育生物学新药开发与药效、毒性评估等第二十八页，共六十六页，编辑于2023年，星期五6.可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选细胞癌变主要是由于正常的细胞周期发生紊乱，细胞无序增殖所致。ES细胞在正常的培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌物质诱发细胞癌变机理的理想材料；在研究新药过程中，需要对药物的作用机理和药效进行研究，ES细胞在体外能分化多种体细胞，可以直接作为实验材料来筛选新药，可缩短新药开发周期，且治疗的针对性强。第二十九页，共六十六页，编辑于2023年，星期五三、胚胎干细胞研究的历史与进展干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科学科研究领域；1999年干细胞研究被美国《SCIENCE》杂志评为1999年度世界十大科学之冠；2000年干细胞研究再次被《SCIENCE》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。第三十页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡的胚胎内细胞团ICM（innercellsmass)获得鼠的ES细胞；同年美国的Maryin用条件培养基获得鼠的ES细胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遗传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和嵌合特性的分析。第三十一页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

1998年11月，美国威斯康星大学的科学家JamesThomson等从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞。他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。第三十二页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干细胞具有可塑性。2000年5月，日本启动“千年世纪工程”，以干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达108亿日元。第三十三页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

2001年1月，英国议会上院通过法案，允许科学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研究。2001年4月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。第三十四页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

2003年，美国卫生独立研究院（NationalInstitutesofHealth，NIH）华裔科学家施松涛等人首次发现牙齿间质存在干细胞。2005年报出干细胞研究领域乃至全球学术界一大学术丑闻：2004及2005年韩国汉城大学教授黄禹锡有关干细胞研究的论文两次荣登Science杂志，结果经各方查证证实其论文数据存在造假现象，2006年Science杂志宣布撤回这两篇论文。第三十五页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

2006年，日本科学家山中亚弥等成功诱导出鼠诱导性多能干细胞（inducedPluripotentStemCell，iPS细胞），此项研究成功将干细胞研究扩充到一个新的领域：重编程！2007年，iPS研究取得巨大进展：山中亚弥等人和汤姆森带领下的华裔科学家俞君英等人分别在Cell及Science发表论文宣布成功利用人类上皮细胞诱导出iPS细胞。第三十六页，共六十六页，编辑于2023年，星期五

2008年，美国科学家解析了microRNAs在干细胞发育及分化中的调控作用，为干细胞日后的研究提供了非常重要的参考资料。2009年3月，美国白头研究所（WhiteheadInstitute）科学家在成功诱导iPS细胞后，巧妙的将诱导iPS时带入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。2009年3月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在iPS研究方面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导iPS基因的载体进行诱导iPS细胞后，随着细胞分裂丢失质粒，可以得到纯净无外源DNA的iPS细胞，在iPS细胞应用安全性方面又进一步。第三十七页，共六十六页，编辑于2023年，星期五四.胚胎干细胞的分离培养基本程序1.胚胎干细胞的分离目前ES细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞团和生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常用。囊胚：尽量选择体内受精的胚胎分离ES细胞；对于相同来源的胚胎选择色泽透亮，ICM明显的胚胎。胎儿性腺脊：经酶消化后，可直接培养在分化抑制培养体系中，一般7d传代一次，直至出现细胞形态均一的克隆细胞团，挑选后进行扩大培养。第三十八页，共六十六页，编辑于2023年，星期五小鼠多用3－4天的胚泡或2－3天的桑椹胚，猪取8－10天的胚泡，绵羊取8－9天的胚泡，人和牛取7－8天的胚泡。第三十九页，共六十六页，编辑于2023年，星期五原始生殖细胞第四十页，共六十六页，编辑于2023年，星期五从胚泡中分离出细胞团的方法主要免疫外科学方法，显微外科学方法和组织培养法等。其中组织培养法是将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，较易获得胚胎干细胞集落。第四十一页，共六十六页，编辑于2023年，星期五（1）免疫外科学方法：该法的原理是利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。以小鼠为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经抗小鼠脾细胞抗血清作用一定时间后再移入含新鲜豚鼠血清的培养液中处理，这样滋养层细胞即被破坏，去除死去的滋养层细胞即得ICM，将ICM离散成卵裂球即可接种培养。此法较为简单，且去除滋养层细胞较彻底，最为常用。第四十二页，共六十六页，编辑于2023年，星期五（2）显微外科学方法：小鼠受精后3-4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养.（3）组织培养法:在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4-6天后，从子宫中取胚泡进行培养。滋养层细胞生长并在培养皿底壁上铺展，而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。第四十三页，共六十六页，编辑于2023年，星期五2.选择抑制细胞分化的培养体系由于ES细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性或多能性和丧失形成嵌合体动物的能力，因此需特殊的培养条件阻止其分化，以确保维持其全能性或多能性。目前常用的抑制细胞分化的培养体系有:1、饲养层培养体系：先用常规的培养液如DMEM对体细胞进行培养，等细胞铺满低壁后，用γ射线照射，使细胞分裂停止，形成特殊的细胞层，即饲养层。然后将囊胚或PGCs与饲养层细胞共培养就可抑制ICM细胞或PGCs的分化，并促进其分裂，进一步分离获得ES细胞。此种方法效率高，结果稳定，较为常用。第四十四页，共六十六页，编辑于2023年，星期五第四十五页，共六十六页，编辑于2023年，星期五2、条件培养体系：直接放入到特殊的培养液中。这种培养液来源于某些细胞如豚鼠肝脏细胞，人膀胱癌细胞和小鼠血管内皮细胞等饲养一段时间后回收的液体。这些细胞在生长过程中不仅能分泌LIF，同时IGF-II等生长因子，能促进ES细胞的生长。第四十六页，共六十六页，编辑于2023年，星期五3、培养液中添加分化抑制因子体系：将分化抑制因子LIF或白介素6（IL-6）家族按照一定浓度直接添加到囊胚或PGCs的培养液中，分离ES细胞。方法简单，且能避免饲养层细胞的干扰。目前只在小鼠 ES细胞取得成功。第四十七页，共六十六页，编辑于2023年，星期五小鼠采用超排卵途径收集胚胎雌性成年小鼠注射5U孕马血清促性腺激素（MPS），48h后再注射5U人绒毛膜促性腺激素（HCG）；与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为0天（即0.5dpc）；第三天至第四天中午（即3.5dpc－4.5dpc）分别剖取孕鼠子宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立ES细胞系；剖取发育至8.5dpc－10.5dpc时的胚胎，可建立小鼠EG细胞系。第四十八页，共六十六页，编辑于2023年，星期五四、ES细胞和EG细胞的培养过程ES细胞的培养过程基本培养液DMEM液

15%－20%FCS0.1mmol/L

β－巯基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml链霉素β-巯基乙醇是一种还原剂，其主要作用是降低氧对细胞产生的氧化损伤，体外培养必须抑制自由基的氧化，所以β-巯基乙醇是保护蛋白不被自由基氧化的很好的高效的物质。第四十九页，共六十六页，编辑于2023年，星期五将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的培养皿中用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离出ICM细胞进一步培养。培养2－3天第五十页，共六十六页，编辑于2023年，星期五免疫手术法4－4.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。具体操作如下：第五十一页，共六十六页，编辑于2023年，星期五体外培养的胚泡，用酸性Tyrode`s液（pH2.5）处理，去除透明带；Hank`s洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗H－2b）；移至含新鲜豚鼠血清的培养液，Hank`s液洗涤后，移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培养液的板内进一步培养。30min胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具H－2b抗原，细胞完整；30min第五十二页，共六十六页，编辑于2023年，星期五常规培养法未去透明带的胚泡培养3－4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来；胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min；解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团；胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。第五十三页，共六十六页，编辑于2023年，星期五五.ES细胞的保存1.常规保存：通过不断的更换分化抑制培养液，以传代培养方式维持ES的不分化状态。如人的ES细胞在体外培养传代2年仍维持不分化状态。2.冷冻保存：通过超低温冷冻保存使细胞的代谢活动完全停止，达到长期保存的目的。第五十四页，共六十六页，编辑于2023年，星期五六.ES细胞的鉴定通过分离培养获得的ICM或PGCs细胞在传到8~12代时，需要通过生化或细胞生物学指标的鉴定最终确认为ES细胞系。1.形态：呈克隆状生长，即单个ES细胞能繁殖呈形态、功能和遗传基础完全相同的一簇细胞，并凝聚成团，外观形似鸟巢。2.阶段特异性胚胎抗原(SSEA)：对细胞表面的SSEA通过化学方法检测，先将细胞用多聚甲醛固定，在用生物素标记的二抗和辣根过氧化物的底物处理，来鉴定细胞表面的特异性糖蛋白。第五十五页，共六十六页，编辑于2023年，星期五3.端粒酶检测：通常ES细胞端粒酶水平远高于其他分化的体细胞，可用正常体细胞或癌细胞做对照，用专用试剂盒检测。4.Apase（碱性磷酸酶）：可通过组织化学方法鉴定，细胞经乙醇或病痛甲醛固定后，直接加入底物，即可鉴定Apase的表达水平，都应该为阳性。5.核型分析：传到2~5代时需要进行核型分析，分析时先在细胞培养液中加入一定浓度的秋水酰胺，使细胞同步在M期，然后用低渗溶液处理，经乙醇冰醋酸溶液固定后染色和显微照相，最后进行核型分析，检测细胞是否维持在二倍体状态。第五十六页，共六十六页，编辑于2023年，星期五6.发育分化潜力：（1）体外诱导分化：是把ES细胞培养在无分化抑制物的普通培养液中，如果ES细胞能自动聚合并分化形成胚状体，可初步确认具有发育多能性；（2）畸胎瘤实验：把ES细胞注射到有免疫缺陷成年小鼠或遗传同质动物的皮下或肾脏、睾丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，可初步判定为细胞具有多能性。第五十七页，共六十六页，编辑于2023年，星期五（3）嵌合体实验：把培养的ES细胞与早期胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES细胞注入囊胚腔，然后让重组胚在体内继续发育，通过检测后代的嵌合状况，分析ES细胞的分化潜力。只有当操作后的胚胎发育为嵌合体，注入的细胞能分化为内、中和外三胚层细胞，并参与细胞生殖干细胞形成时，才能确认为ES细胞。目前，只有小鼠、猴和人能到达以上指标。第五十八页，共六十六页，编辑于2023年，星期五1如何维持体外扩增时不分化？2分化细胞的增殖是一个瓶颈问题：数量和纯度3如何定向诱导干细胞的分化？明确干细胞发育的调控机制4胚胎干细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破5如何