细胞生物学（王金发版）第二章细胞生物学研究方法

第二章细胞生物学研究方法细胞生物学以细胞为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点研究细胞和细胞器结构和功能、细胞生活史和各种生命活动。1．细胞结构、成分的观察-显微成像技术原理：照明系统发出的光线或电子束通过样品时，与样品发生相互作用，其被改变的物理特征被肉眼观察或通过探测器检测而成像。分辨率：r=0.61λ/nsinα；分辨极限：一定波长的射线不能用以探测比它本身波长短得多的结构细节。1.1普通光学显微镜及样品制备1.1.1各种光学显微镜普通光学显微镜荧光显微镜：利用紫外线为光源照射样品，使之发生荧光。相差显微镜：将不同成分的衍射系数改变为明暗变化。暗视野显微镜：利用散射或衍射光增大反差。倒置显微镜：普通光学显微镜的倒置。1.1.2样品制备取材、固定（杀死细胞，稳定细胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、染色、观察。放射性自显影：放射性同位素标记、底片。1.2电子显微镜及其样品制备1.2.1电子显微镜透射电子显微镜照明系统为电子束，电磁透镜调整电子束的亮度与聚焦，真空系统保护电子枪等。扫描电子显微镜极狭窄电子束扫描样品，利用样品表面形成的二次电子信号成像。扫描透射电子显微镜透射电子显微镜与扫描电子显微镜的结合：电子束扫描，透射电子成像。1.2.2样品制备步骤：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（负染色等）、观察（放在载网上）。负染色：利用重金属盐对样品进行染色，电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。喷镀技术：以一定角度在样品的表面镀上一层金属，增强背景和待观察样品反差的方法。冷冻断裂复型和冷冻蚀刻：生物样品在液氮中迅速冷冻，然后迅速放入冷冻装置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后观察切口表面；或将其温度稍微升高，使样品中的冰升华，会在表面浮雕出细胞膜的超微结构。1.3间接成像技术扫描隧道显微镜：利用量子力学的隧道效应，探针尖端与样品表面可产生隧道电流，其值与距离呈指数变化关系。原子力显微镜：扫描隧道显微镜修改，利用探针原子与样品表面的原子力的变化。X射线衍射技术：在原子分辨的水平上推测分子的结构。2．细胞成分的组成、分布-细胞化学技术2.1酶细胞化学技术初级反应：细胞内酶作用于底物产生初级反应产物。捕捉反应：初级反应产物与捕捉剂相互作用，产生显微镜下可见的最终反应产物。2.2免疫细胞化学技术利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布。包括免疫荧光技术和免疫电镜技术。2.3其它显微分光光度术、显微荧光光度术用来对相关成分进行定性、定量、分布的观察。核磁共振技术分析有机化合物结构。3．细胞及成分的分离-细胞分选技术、分离技术3.1细胞分选技术流式细胞仪：流室，激光光源，讯号检测器，讯号分析部件，无细胞液滴收集器。细胞分选过程：细胞液经流室形成单细胞悬液，激光检测带有荧光标记的细胞，信号检测分析使液滴充电，经电场分选进入无细胞液滴收集器。3.2分离技术3.2.1离心分离技术（1）速度离心分离细胞器和大分子在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降速度也就不同，体积大的沉降快。差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。移动区带离心：利用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，较长时间的离心。建立密度梯度的原因使防止扩散，但任一组分的密度都大于连续密度的最大值。（2）等速度离心分离细胞器和大分子利用介质产生一种密度梯度，覆盖了待分离物质的密度，通过离心使不同密度的颗粒停留在相应的介质密度区。介质可以是蔗糖或甘油，其密度较小，适于分离细胞器等；或利用CsCl，能够自发建立密度梯度，同时密度比较大，适合分离DNA,RNA等。3.2.2层析分离技术根据混合物中各组分在物理化学性质等方面的差异在固定相与流动相间进行反复多次的分配而得以使各组分的移动速度产生差异而分离。（1）凝胶过滤层析根据蛋白质的大小和形状进行分离纯化。（2）亲和层析根据生物分子中有些分子的特定结合特性分离纯化成分。（3）离子交换层析根据蛋白质在不同pH环境下具有不同的带电特性，而与固定相的特定电荷相互作用而分离纯化。4．细胞培养-细胞工程技术在体外模拟体内的生理环境，培养从机体取出的细胞。4.1培养条件注意三个环节：营养、生存环境、废物的排除。4.2培养过程原代细胞培养产生细胞系，再经传代培养得到具有特殊性质或标志的细胞株。4.3培养方法悬浮培养、贴壁培养。5．与其它学科结合的相关技术-单克隆抗体技术、显微操作技术、分子生物学方法等5.1单克隆抗体技术B细胞与突变的骨髓肿瘤细胞发生细胞融合，产生既能产生单一抗体，又能不断增殖的杂种细胞。5.2显微操作术用于对细胞的解剖手术及微量注射的技术。5.3分子生物学方法5.3.1基因工程选择目的基因构建工程质粒，导入载体中表达，产生产品或进行基因功能的分析。5.3.2P复制目的DNA片段。步骤：引物设计和合成、DNA模版的制备、PCR反应、产物的分离和纯化。5.3.3选择性基因Knockout和转基因鼠目的基因插入正选择标记基因，末端插入负选择标记，导入胚胎干细胞，进行基因重组，然后筛选出正确重