分子生物学基因重组和基因工程

分子生物学基因重组和基因工程第一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五DNA克隆、测序与重组技术的历史1973年，StanleyCohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化学裂解DNA测序问世不久，Sanger等的双脱氧测序法20世纪90年代启动人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)重组DNA技术学(RecombinantDNATechnology)第二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第一节

自然界DNA重组和基因转移是经常发生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五自然界不同物种或个体之间的基因重组和基因转移是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。基因转移和重组也在繁殖、病毒感染、基因表达及癌基因激活等过程中起重要作用人类进行基因克隆、动物克隆以及基因治疗等科学实验和实践中所进行的基因操作也离不开基因转移和重组。重组DNA技术就是基于人们对自然界的基因转移和重组的认识发展起来的。第四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五基因重组（Genere-arrangement，recombination）是指整段DNA在细胞内或细胞间、甚至在不同物种之间进行交换，井能在新的位置上复制、转录和翻译。是自然界常见的现象，基因重组有病毒介导的基因转移，细胞在增殖、分裂、分化过程也发生基因重组或重排（rearrangement）基因重组有多种方式。第五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五DNA重组接合作用

(conjugation)转化作用

(transformation)转导作用

(transduction)转

座

(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)第六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。一、同源重组是最基本的DNA重组方式第七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五同源重组需要一些重组蛋白和酶。如RecA、B、C、D及DNA连接酶等。同源重组不依赖特异DNA序列，而依赖两分子之间的相同或相似性。若转化或转导获得的外源DNA与宿主DNA同源,那么外源DNA就可以整合进宿主的染色体。第八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五Holliday模型的4个关键步骤：

两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：第九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五片段重组体

（见模型图左边产物）：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组

体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：

切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。

第十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)第十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体第十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´第十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体②①①②5´3´5´5´5´3´3´3´第十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五二、接合作用（conjugation）当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。细菌的基因转移与重组方式第十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒第十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五有的细菌染色体外有一比较大的质粒-F因子(Ffactor)，是一个小型环状双链DNA。F因子中含有性鞭毛蛋白编码基因，这决定性鞭毛的形成。有F因子的细菌有性鞭毛。当F+和F-的细菌相互接触的时候，它们之间通过鞭毛的连接构成通道，F+细菌中双连DNA的一条链打开一个缺口，进入另一个细菌，F+细菌按滚环复制另一条链；进入F-细菌的那条连做模板，复制成两条链，这样两个细菌都成为F+细菌。质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子第十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五三、转化作用(transformation)定义：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化。第十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

肺炎双球菌存在无夹膜不致病的无毒型（RH型）和有夹膜的致病型的肺炎双球菌（SH型）。提取致病型肺炎双球菌的DNA，加入到RH型菌里培养，RH型就会转化成致病的SH型肺炎双球菌转化实验：第十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五四、转导作用(transduction)当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。第二十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)噬菌体感染细菌时，其外壳留在细菌的表面，噬菌体DNA进入大肠杆菌细胞内，在细菌细胞内其生活途径有两种：第二十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径

(lysogenicpathway)第二十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五1、溶菌生长途径(lysispathway)λDNA在细菌内复制，也可以表达产生噬菌体的外壳蛋白，然后包装成新的λ噬菌体，当生成大量的λ噬菌体后，细胞溶解，

噬菌体就释放出来了。第二十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。第二十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

2、溶源菌生长途径(lysogenicpathway)

λDNA进入细菌后，可以通过基因重组整合到细菌染色体DNA中，维持下去，随着细菌的分裂繁殖，λDNA被扩增，当在一定条件下，这一段λDNA可以被切下来扩增、复制，进入溶菌途径。如果λDNA切下时带有了细菌的DNA,包装成噬菌体后，新的噬菌体DNA就带有细菌DNA,当其再感染另外的一个细菌时，通过溶源途径，就将原细菌的DNA，带给了新的细菌，这就是转导作用。第二十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五目录第二十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五五、位点特异重组，即特异位点间发生的整合位点特异重组(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。第二十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌体DNA的整合第二十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。第二十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。第三十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变第三十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。

轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLV

D

JC第三十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段第三十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程第三十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五六、转座(transposition)由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

第三十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

插入序列(insertionsequences,IS)组成：（一）插入序列转座二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列：

9－41bp,位于两侧特有的正向重复序列：4－12bp，位于反向重复序列外侧，为插入序列所特有。一个转座酶（transposase)编码基因：产物是转座酶，引起转座，位于中间长750－1500bp正向重复序列正向重复序列IRTransposaseGeneIR其组成为：第三十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五插入序列发生转座的形式：1、保守性转座(conservativetransposition)：2、复制性转座(duplicativetransposition)：从原位迁至新位插入序列复制后，一个复制本迁到新位，另一个保留在原位。第三十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五转座子Transposon末端反向重复序列TerminalrepeatsTargetDNATransposasemakesstaggeredcutsinthetargetsiteTransposaseGene1、保守性转座错位开切转座子第三十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五转座子TransposonThetransposonisinsterdatthesiteofthecutsReplicationfillsinthegapsduplicatingthesequencesflankingThetransposon复制转座子的旁侧

序列，填补空隙第三十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五2､插入序列的复制性转座第四十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第四十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五插入序列的复制性转座第四十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：

反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因第四十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L第四十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五由转座子介导的转座第四十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第二节

重组DNA技术

又称DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第四十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年

美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年

美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年

开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年

英国罗林研究所成功的克隆了多莉。第四十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五相关概念DNA克隆

工具酶

目的基因

基因载体基本原理

重组DNA技术与医学的关系主要内容：第四十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化(cloning):

获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。（一）DNA克隆分子克隆

（DNA克隆）细胞克隆

个体克隆

（动物或植物）

技术水平

第四十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)即重组体，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆各种来源的DNA即目的DNA,也叫外源DNA第五十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等

目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA技术/重组DNA工艺学。第五十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（二）工具酶

限制性核酸内切酶（基因工程中重要的酶）

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶(PCR技术中应用的一种耐热的DNA聚合酶，95度不变性)第五十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五重组DNA技术中常用的工具酶工

具

酶功

能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第五十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内是细菌内存在的保护性酶，如果有外来的DNA进入细菌内，则RE将其水解掉，对细菌自身起保护作用。限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，RE)第五十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五发现1970年，美国的HamiltonSmith偶然发现，流感嗜血杆菌（HaemophilusinfluenzaeRd）能降解外源噬菌体DNA，且该菌的无细胞的抽提液也具有降解（酶）活性。该酶能降解E.coliDNA，但不降解产生该酶的Haemophilus自身细胞DNA，称该酶为HindⅡ，能结合并识别的DNA序列为：限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的位点切断双链，被称为“分子剪刀”。5′-G-T-Py-↓-Pu-A-C-3′3′-C-A-Pu-↑-Py-T-G-5′（Py=嘧啶、Pu=嘌呤）第五十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

特点1）均来自微生物，并据此而进行命名；2）特异识别连续的4、6或8个碱基；按其识别顺序可以计算切割几率：假定四种碱基在DNA链上随机分布，则识别4、6、8个碱基顺序出现的几率分别是1/44、1/46、1/48（识别顺序出现的碱基间隔）。识别序列越长、切点越少。3）识别序列多具有回文结构（palindrome）；即识别序列呈二元旋转对称。回文结构多数不是重要的结构基因。4）其切割后的DNA可产生不同的末端。第五十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五作用：GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）

与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。回文结构第五十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin

dⅢ

属

系

株

序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第五十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五I：切割位点：非特异性，跟识别位点大于1000bpII:同于或接近于识别部位III:跟识别位点3端24-26bp处切割位点：第五十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

限制修饰系统

(RestrictionandModificationSystem)限制性核酸内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA第六十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口

：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第六十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五二元旋转对称，即从到的方向阅读是完全相同的5´3´

识别的回文结构为短小序列大多为4-6bp回文结构指的是：二元旋转对称(180度旋转)，即点对称注意：线对称不是回文结构第六十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第六十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五限制性核酸内切酶识别序列长度为4－8个bp，6个最多见。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend),可用连接酶连接。粘性末端端突出端突出5´－3´－5´AATTC——3´G——5´G——3´AATTC——第六十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五SATORAREPOTENETOPERAROTAS具有反向重复序列的是：A、CGGTAGCTAGTTCGB、CGAGGATTAGGAGCC、AAGGTTCGAACCTTD、TTACGTATTACGTA第六十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：第六十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶第六十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五名称

识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性内切核酸酶第六十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（三）目的基因(targetgene)

应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。

应用重组DNA技术的目：1、为分离、获得某种感兴趣的基因或DNA序列，即目的基因（targetDNA）或外源DNA。2､为获得目的基因的表达产物—蛋白质第六十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五cDNA(complementaryDNA)双称互补DNA

指经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。

基因组DNA(genomicDNA)

指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

目的基因的类型：DNA克隆时构建的嵌合体DNA组成包括：载体DNA+目的DNA第七十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五获取目的基因的方法：1、直接从组织或细胞染色体DNA中分离，限制性酶切；2、利用DNA合成仪化学法合成，或用PCR法扩增；3、提取mRNA反转录合成cDNA直接克隆，或建立c-文库再从中筛选。4、利用鸟枪法建立G-文库，再用核酸探针从基因文库中“钓”取。5、PCR方法第七十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（四）基因载体

定义能携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的可独立复制的完整的一些DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。

常用载体质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA第七十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。(大量获得基因片段)表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成

多肽链而特意设计的载体称为表达载体。(大量获得表达产物)第七十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。第七十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五理想基因载体应具备的条件可在宿主细胞内自行复制（具有自身的复制子并能携带外源性DNA一同扩增）；有多种限制性核酸内切酶的单一切割位点（多克隆位点）；载体分子应尽可能小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；有两个以上的筛选标记（抗药性、酶基因、营养缺陷型、形成嗜菌斑等）。拷贝数多、与宿主易于分离、抗剪切力强。表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、前导顺序、增强子等。第七十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五质粒

(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1－3个抗药性基因，以利于筛选，能加0.1－10kb的基因第七十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五以大肠杆菌中的质粒载体为例：大肠杆菌有一套自己的染色体，在染色体之外还有一环状DNA拿出来，因为它体积小，容易操作，通过人工改造变成载体。载体有几个重要部分：1、用来复制的部分：克隆的话需要复制，要有调控的元件2、人工改造的部分，用来筛选转到细胞是否成功。因为这一段的编码产物可以对抗抗菌素对宿主细胞的杀伤。如氨苄青霉素抗性基因，根据需要的不同选择不同的抗性基因。3、装上LacZ基因：乳糖操纵子，外界给了乳糖，可变成半乳糖，如果没有葡萄糖LacZ如果成功转到大肠杆菌，就会产生在含有X-gal、IPTG的培养基培养，B-半糖苷酶分解X-gal的显色反应很灵敏。B-半糖苷酶可以分解X-gal变成蓝色，如果这个基因遭到破坏，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色，IPTG半乳糖的类似物，很有效地启动乳糖操纵子的基因转录。第七十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五人工构建质粒PBR322全长4363碱基对，有一个复制起始点，2个抗生素的抗性基因（氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因）有多个单一的酶切位点第七十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第七十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆－目的基因较小）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆－目的基因较在大）噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第八十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五对λ噬菌体DNA中间部分进行改造，替换原来的结构基因，装上目的基因，利用它容易感染原核和真核细胞的性质，把目的基因带进去，其容量高，80－20Kb病毒载体用的越来越多，因为病毒感染细胞的效率非常高（如，大肠杆菌载体效率不高）而病毒几乎百分之百。病毒依靠表面的蛋白质与宿主细胞结合，去感染，把它的内容物释放到宿主细胞内。病毒基因组在两头有包装信号，中间是病毒的结构基因，第一步改造是把两头的结构信号拿掉，仅把结构基因重组，转到宿主细胞，能转成功的话，进入的全是结构基因与宿主的基因组整合，利用宿主的一切系统，把它的所有基因产物表达出来，在胞浆呆着，叫包装细胞；第二步，包装信号与目的基因重组，然后再与载体重组，转染到刚才已经建好的包装细胞中。包装信号是与目的基因连在一起的，利用宿主的基因组不断复制更多的带目的基因和包装信号的片段，这些片段当它与与已经有了的病毒蛋白相遇，包装信号发挥作用，可以包装成新的病毒（含有目基因但没有病毒的结构基因了），有感染力但无结构基因了。第八十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

柯斯质粒(cosmid)酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)

细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)

动物病毒DNA改造的载体

（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）3、其他第八十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五粘性质粒(cosmid)第八十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第八十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五如果要获得一个DNA克隆，操作：1、从真核生物染色体DNA中获取目的DNA。2、基因载体的选择和构建，如质粒。3、将载体和目的基因用同一种限制性内切酶来切割，产生相同的粘性末端。4、切割后将载体与目的基因连接起来（外源基因与载体的并接成重组体）。5、将重组体导入受体细菌（细胞）。6、筛选出含有重组体的转化子细胞，并无性繁殖重组体的目的基因（细菌扩增得到DNA克隆）。7、如果要获得蛋白质，最终还需要表达。第八十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五Host宿主细胞E.Coli–the“factory”usedinthegeneticengineeringofinsulin第八十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五有了基因有了载体，要想最终实现获得大量基因或产物，最终都要放到hostcells实现。最常用的有3类：大肠杆菌、单细胞的真核生物（酵母B4）真核哺育类细胞。拿基因根据目的不同，取的组织或细胞不同第八十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

以

质

粒

为

载

体

的DNA

克

隆

过

程第八十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（一）目的基因的获取－分化学合成法（化学合成仪）

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

；或可推导出序列的基因，如胰岛素的基因、干扰素的基因。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)(见第22章)第八十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五1､化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。第九十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G－文库。它表达了细胞整套基因。2、从基因组DNA文库获取目的基因第九十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五基因文库：提纯生物体全部DNA，用限制性内切酶随机切割成大致相同的数以万计的片段，重组入同一类载体上，转化宿主菌保存，即得基因文库。（1）G-文库：用基因组总DNA制备的基因库。（2）c-文库：用细胞全部mRNA经反转录制备全套cDNA后建立的基因库。G-文库比c-文库基因数目多第九十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五就研究一个基因，而且知道这个基因组织中是表达的，表达量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑电泳，成功的RNA是5.8S18S28S三个条带非常清楚，如果5.8S不清楚，凑合用，如果28S18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA实验时要在一个独立的空间，所有东西都独立，不能与别的实验混合。得到的是总RNA，我们需要的是mRNA，mRNA尾巴上有polyA，利用这个特别纯化，去掉tRNA、rRNA，有了mRNA为模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相当稳定，可以长期保存下来。有了cDNA，酶、引物、底物通过PCR技术，大量扩增。由于知道想做的这段基因的分子量，如果想知道这段基因的分子量，跑电泳，就可以大概知道拿到的这段基因是不是想要的基因，如果与理论基因分子量是对应的，那就可能是，最终的结论还需要测序。如果是想要的基因，与载体重组，重组后转到细胞内，转到细胞有三种方法：化学的、物理的，生物的。物理的方法比较简单有基因枪，电转；化学的方法，比如用Ca2+Cl2处理细胞，细胞表面的膜变得疏松，载体容易进入。质子体感染、病毒感染等都可以转入细胞是否转进去，就开始筛。用抗生素先筛质粒是否转进去了，再用蓝白斑筛目的基因是否进去（蓝斑没有进去，白斑进去了）第九十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五限制酶切位点限制酶消化

除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化

外源DNA与载体DNA混合

连接反应

体外包装

用重组噬菌体感染大肠杆菌

~20KbDNA片段

cosLRcos~20Kb外源DNA片段

基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库

第九十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子

cDNA文库

反转录酶

载体

受体菌

复制3、

从cDNA文库获取目的基因

提取细胞全部的mRNA做模板，通过逆转录合成互补的全套双链cDNA后,建立的基因文库。

简称c－文库。第九十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

cDNA文库逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT第九十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。(polymerasechainreaction)

PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。4、聚合酶链反应（PCR）第九十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第九十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五第九十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

PCR是根据复制的原理，在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或者cDNA的专门技术。

PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNT及含有Mg2+的冲液（激活剂）。第一百页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五1、变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性解开成单链；2、退火（复性）：将温度降至适宜（50℃左右），使引物与模板DNA互补结合；3、延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底

物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。上述三个步骤为一个循环，经过25－30次循环后，指数增长可将模板DNA扩增达百万倍。PCR的基本反应步骤及原理

第一百零一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

PCR反应条件

变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第一百零二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（二）克隆载体的选择和构建－选根据目的基因的性质、含有哪种核酸内切酶的酶切位点、目的基因片段的大小等选择适当的克隆载体，目前克隆载体已商品化，购买即可。目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。第一百零三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五载体插入DNA片段宿主细胞质粒<5~10kb细菌，酵母λ噬菌体载体~20kb细菌黏粒~50kb细菌BAC~400kb细菌YAC~3Mb酵母不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞第一百零四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（三）外源基因与载体的连接－

接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接（连接成重组体）第一百零五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五粘性末端连接

GGATCCCCTAGG

GGATCCCCTAGG

G

GATCCCCTAG

G

G

GATCCCCTAG

G

GGATCCCCTAGGDNA连接酶

目的基因DNA和载体DNA都含有同一个限制性内切酶的酶切点，用同一种酶来切割，产生相同的粘性末端（配伍末端）。第一百零六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用

BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接第一百零七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。第一百零八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五平端连接

适用于：限制性内切酶切割产生的平端不是配伍的粘端经特殊酶的处理（补齐或切平）变为平端。如末端核酸转移酶将其补齐或用核酸内切酶将突出的一端其水解掉，切平变为平端。第一百零九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因

自连第一百一十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五同聚物加尾连接由末端转移酶(terminaltransferase)的作用，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。如将两条链的一条链接上TTTT,另一条链的末端都接上AAAA，TTTT和AAAA就成了互补的末端，就可以连接。第一百一十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´第一百一十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

人工接头(linker)连接人工接头是一段含有限制性内切酶的酶切位点的寡核苷酸。将平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸链（即加上人工接头），再用限制性内切酶来切除产生粘性末端，而进行粘端连接。也就是将载体和目的基因都加上人工接头，或者是目的基因已经有了一个限制性内切酶的粘性末端，可以在载体上加一人工接头，产生相同的粘性末端。第一百一十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第一百一十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五受体菌条件：安全宿主菌（人工处理不致病的大肠杆菌）

限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

容易接受重组DNA）

导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌－转第一百一十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（五）重组体的筛选与鉴定－筛重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening)或选择（selecting)。第一百一十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五1.借助载体上的遗传标志进行筛选

(1)利用抗生素抗性标志筛选(2)利用基因的插入失活/插入表达特性筛选(3)利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选

筛第一百一十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五2.序列特异性筛选

(1)RE酶切法(2)PCR法

(3)核酸杂交法(4)DNA测序法

3.亲和筛选法第一百一十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等重组体的筛选方法有：第一百一十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。

(1)抗药性标记选择

(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交

Southern印迹1、直接选择法第一百二十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（1）、抗药性标记法（插入失活法）将目的基因插入带苄青霉素抗性基因（amp）和四环素抗性基因（tet）的载体中的tet基因中（两个抗性基因之一中），则被插入的tet基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含有四环素的两个培养基中培养，然后再进行筛选。如果基因不失活，比如氨苄青霉素基因不失活，那么在氨苄青霉素存在的情况下培养能生长，可以抵抗抗生素（氨苄青霉素）；如果这个基因失活了，在含有四环素的培养基中就不能抵抗四环素，在含有四环素的培养基中就不能生长。根据生长情况来筛选。第一百二十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五(插入失活法)

抗药性标记选择第一百二十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五如质粒pBR322,含有氨苄青霉素和四环素两种抗性基因，将目的基因插入到四环素抗性基因的位置，如果重组成功了，插入后转入受体菌进行培养，在含有氨苄青霉素的培养基中能生长（氨苄青霉素基因正常）；在含有四环素的培养基中不生长，可判断重组体重组成功，如果没重组成功，它在含氨苄青霉素和四环素的培养基中都生长，以此来判断哪个是重组体，哪个不是重组体。第一百二十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（2）、标志补救（markerrescue）若目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对营养素的依赖表型来筛选。如α互补的原理：第一百二十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18X-gal

:半乳糖苷酶的底物IPTG:乳糖操纵子的强诱导剂第一百二十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五噬菌体构建的质粒PUC1819，含有lacZ基因，编码的蛋白质是B-半乳糖苷酶，但它是N端的部分序列。要转入的大肠杆菌的染色体中含有B-半乳糖苷酶的C端编码序列，只有这个质粒转到细菌后，质凿的基因和大肠杆菌的基因同时表达，然后两个结合在一起，细菌才有B-半乳糖苷酶活性，有了B-半乳糖苷酶活性才可以水解乳糖，水解乳糖后产生蓝色的菌落。这个细菌就是营养缺陷性的，它缺陷B-半乳糖苷酶的N端序列，质粒补充了它的B-半乳糖苷酶基因的活性。

LacZ基因附近有一个多克隆位点，在这个位点可以插入外源DNA,如果插入了外源DNA就破坏了N端编码序列，破坏之后再转化到细菌内它就不能够编码B-半乳糖苷酶的N端，就不能补充营养缺陷，这个细菌就没有B-半乳糖苷酶的活性，在培养基中培养就是白色的菌落。蓝色菌落表示外源DNA没有插入进来，如果插进来就是白色菌落。我们需要的是白色菌落，是含有重组体的细菌。将它拿出来后再扩增。（P359页图14－13）上图解释：第一百二十六页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

加入的X－gal是B-半乳糖苷酶的底物，IPTG是实验室常用的乳糖操纵子的强诱导剂（比半乳糖的作用要强），诱导后乳糖操纵子才能表达。第一百二十七页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录第一百二十八页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五（3）、分子杂交法：利用P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。有两种方法：原位杂交Southern印迹一般筛选需要几种方法联合使用。32第一百二十九页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

原位杂交第一百三十页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

Southern印迹第一百三十一页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五2.非直接选择法：

免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括：免疫化学方法酶免检测分析因为此方法不直接鉴定基因，是鉴定的基因表达产物所以称非直接选择法。第一百三十二页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法

第一百三十三页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（产生蛋白质）表达体系分：原核表达体系：

(E.coli表达体系最为常用)

真核表达体系：

（如：酵母、昆虫、乳类动物细胞）第一百三十四页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点

E.coli表达体系的不足：缺乏转录后和翻译后的加工机制不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体

(inclusionbody)

；很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用)第一百三十五页，共一百五十九页，编辑于2023年，星期五

优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA