【精品课件】5.3血红蛋白的提取和分离

万晓军生物工作室1课题3

血红蛋白的提取和分离

万晓军生物工作室2一、基础知识：（一）蛋白质提取和分离原理

（二）蛋白质提取和分离的方法

1）凝胶色谱法：又称分配色谱法

2）电泳法（三）缓冲液的作用万晓军生物工作室3二、实验操作－－实验步骤样品处理和粗分离纯化纯度鉴定

血液组成成分

1.洗涤红细胞

2.释放血红蛋白

3.分离血红蛋白

4.透析血红蛋白万晓军生物工作室4二、实验操作－－实验步骤

血液组成成分

1.洗涤红细胞

2.释放血红蛋白

3.分离血红蛋白

4.透析血红蛋白样品处理和粗分离纯化纯度鉴定万晓军生物工作室5蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质差异：

1.分子的形状、大小

2.电荷性质和多少

3.溶解度

4.吸附性质

5.对其他分子亲和力

万晓军生物工作室61.凝胶色谱法

（1）原理：（2）材料：凝胶大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法概念：万晓军生物工作室7洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

万晓军生物工作室82．凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷万晓军生物工作室92．凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？万晓军生物工作室103）常用电泳方法

琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

万晓军生物工作室11影响蛋白质分子运动速度的因素

决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√万晓军生物工作室12由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）缓冲溶液－－洗脱剂

作用：

配制：调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？万晓军生物工作室13血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链

亚铁血红素万晓军生物工作室141.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色万晓军生物工作室152.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂万晓军生物工作室16滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白万晓军生物工作室1720mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质万晓军生物工作室18纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱万晓军生物工作室19步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？万晓军生物工作室20注意：色谱柱不能内不能有气泡；装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝胶是凝胶装填紧密万晓军生物工作室213.样品的加入和洗脱

1.调液面2.加样3.再调液面

4.洗脱5.收集缓冲液凝胶万晓军生物工作室22注意事项1.红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3.凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。Why？万晓军生物工作室23知识总结血红蛋白的提取和分离