实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测

实验一

质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测(高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克)

实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果及讨论一、实验目的了解高纯质粒小量制备试剂盒和碱法提取质粒的原理掌握百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法提取质粒的方法二、实验原理

(百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法)

本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。

一、原理简介

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

实验原理（碱法）质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。载体结构的三大要素：

多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位载体种类：

质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等pBCSKmap三、实验仪器、材料与试剂

（一）仪器

恒温摇床超净工作台高压灭菌锅高速台式离心机微量取液器、1.5mLEP管LB液体和固体培养基卷纸、无水乙醇、双蒸水（二）材料和试剂含pUM-T(pMD18-T或KS，pRT101)质粒的大肠杆菌DH10B（DH5α或HB101）。含外源基因的重组pUM-T(pMD18-T或KS，pRT101)质粒的大肠杆菌DH10B（DH5α或HB101）。氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成50-100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。

pMD18-TVector

LB液体培养基（1L）：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g。加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。5.LB固体培养基（1L）：

在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉(Agar)15g。四、实验步骤

百泰克高纯质粒小量制备试剂盒

第一交次使享用前沉请先盛在15垮ml饰(25停ml)漂洗木液WB中加浸入45徐ml参(75快ml)无水般乙醇!将RN谢as仙eA全部该加入叔溶液P1中，混匀，每魔次使叫用后书置于2-留8℃保存。取1.拔5-密4.隆5毫升过夜冷培养号的菌赤液，90福00这rp扑m，离危心30秒，弃上旁清，巡寿收集疾菌体，晋尽可缠能的倒干却上清。处理逃超过1.啄5毫升缘瑞菌液蜡可以济离心蛙去上插清后僵，在展同一狸个1.栗5m组l管内摘加入启更多或的菌唯液，名重复轻步骤1，直攀到收舱集到紫足够伴的菌秋体。2.用25蛛0μl溶液P1重悬危菌体坦沉淀，涡旋神振荡至彻系底悬麦浮。如果循有未范彻底亡混匀阴的菌鸽块，番会影伪响裂辛解，欣导致葵提取旱量和年纯裂度偏荐低。3.加25拐0μl的溶覆液P2，温和昂的上下丘翻转6-宽10次使菌婶体充分苹裂解，直怜到溶椅液变全得清亮。温和稳的混臭匀，伸不要暖剧烈变震荡体，以免表基因絮组DN万A剪切仅断裂扬！所用门时不应宪超过5分钟！以稍免质芹粒受新到破兵坏。储此时包菌液幅应变舱得清亮好粘稠，如薯果菌甩体少判，很渡快清影亮粘旬稠后素就可欢以做科下一勤步。4.加40赛0μl溶液P3，立即文温和的上熔下翻妥转6-塌10次，室印温放置5分钟。室胆温13，00艺0r粥pm离心10分钟，小心取上拿清。5豪.竿(将吸附灿柱安置斜于收集咏管上，窑加入50砌0μl溶液P4，室然温13唉,0魄00绞rp凑m离心1分钟，弃习滤液岛；)将上一滨步所籍得上炕清液加入墨吸附映柱AC中（青吸附强柱放所入收糕集管或中）哗，13护,0怠00蛋rp盆m离心1分钟，弃够滤液者。6.加入50喷0μl去蛋叛白液PE，13傻,0御00证rp手m离心30班-6马0秒，弃应滤液融。此步万骤为辟了去除勺痕量绿核酸岗酶等杂缺质，覆如所旅用翼菌株锣为JM系列祝、HB裁10罚1等，身因为姨核酸厦酶含距量丰梁富，岗应加衰此步缸骤；尊如所怨用菌彩株为XL堆-1绍B机lu核e和DH横5α等，街核酸红酶含议量低框，则冒可忽蒜略此寺步骤谈。加入50好0μl漂洗钓液WB（请辈先检舌查是响否已狡加入无水服乙醇！）执，13墨,0胆00浙rp趋m离心30渣-6辜0秒，弃貌滤液拐。重复步骤7一次脑，13现,0嗓00末rp恢m离心30穴-6驴0秒，弃位滤液厨。空柱13滚,0腊00聋rp敢m离心2分钟。室温放置3-层5分钟，除窗去残央留乙及醇。9.取出涨吸附匹柱AC，放则入一宴个干扣净的右离心堵管中晃，在吸附核膜的中间慕部位加60模-1暮00μl洗脱杰缓冲乡丰液EB或双蒸修水（洗锣脱缓究冲液冠事先特在65发℃-项70扁℃水浴第中加或热效呀果更好正）,室温放置1分钟，13志,0株00暑rp锹m离心1分钟洗脱料质粒DN傅A，可欣立即廊用于拥下游汪分子钉生物教学实哑验或-2堵0℃保存极。洗脱坛体积越大蓝，洗项脱效极率越照高，如纵果需近要质脸粒浓欣度较朗高，蒜可以杆适当腐减少扔洗脱毒体积固，但去是最小品不应琴少于50μl，体积鞋过小美降低云质粒酬洗脱圾效率，减社少质秤粒产展量。五、院实验恳结果定与讨粥论1.实验科结果2.讨论附I：碱倚法提剂取质勒粒的耀原理锹和方轨法(一)试剂补等1.So闸lu纲ti情on冤Ⅰ50mm像ol/L葡萄症糖25mm污ol/LTr徐is蛙.·告Cl(p雪H绘8.脚0)10mm晃ol/L宝E津DT树A戴(p牢H息8.妇0)高压附灭菌这后，4℃保存刻备用蜂。2.So贱lu酿ti新on短Ⅱ(现用惕现配疑制)0.蚊2配mo胀l/她LNa纷OH1%加SD陡S3.So雹lu魄ti阿on娃Ⅲ（10捧0乏ml）：5m躲ol桂/LKA葡c60概m季l冰醋捞酸11指.5增m毅l水28姿.5亩m隐l配制丸成的痕溶液Ⅲ含3闹mo居l/猛L钾盐初、5雾mo盛l/浙L醋酸提（pH序4牺.8）。4.胰RN继A酶：将回胰RN翻A酶（RN熟A酶A）溶咬于10mm味ol/LTr害is锤.C筛l(p伙H开7.富5)、15mm恩ol/LNa跪Cl中，谱配成10欠m懂g/亭ml的浓粉度，毫于10滩0℃加热15分钟让，缓宴慢冷竞却至鲜室温音，分昂装成据小份沈保存熟于-2俘0℃。5.氯仿饮，乙闷醇换，70匹%乙醇。（二唯）实通验步却骤用灭庭菌的旷牙签作挑取座单菌讲落放烛入50榨ml志L蓝B液体挨培养胸基（严含Am耕p0.院1mg倍/m吗l）中，37字℃振荡鼓培养过夜鹿。将菌眯液倒切入1.必5mlEp主pe释nd想or跪f管中洪，10河,0卫00腿r讨pm离心1m芬in，去掉嚷上清效液，注重复两次。沉淀奶悬于20暴0μ宴LSo烟lu销ti往on天I中,涡旋距使充分校悬浮。加入30岩0μ由LSo捡lu授ti描on脾II，混匀（拦注意动作怨轻），唉冰箱3妇℃放置5森mi伍n。加入30到0μ掉LSo撕lu股ti仿on计II秀I,混匀切（注纲意动作愉轻）摘，冰混箱3搭℃放置5启mi帅n。12揭,0沫00盐rp傲m，离心5m桑in，将上望清移秘至1个新Ep鞋pe体nd励or触f管中主，注迁意所李取体掠积（忧约60拖0绘μL）着。加入等体海积氯缴仿（约60呼0怖μL），混匀（注享意动浪作轻脊）。12铲,0志00扑rp奖m，4℃，离心10屋mi稿n，取上清液。上清染液中加利入预冷渔的等米体积艳异丙忧醇，-2亦0℃沉淀20怜~3呆0盯mi摇n。12且,0硬00鸭r啄pm离心15遵m病in。去上每清，沉淀加入50戒0μ凯L70柳%乙醇洗涤2次（12禁,0嫁00貌r筝pm离心3分钟势）。去掉水上清靠（注料意沉东淀勿晴丢失减），首室温袜或真空净干燥沉淀幅。每管志中加号入25弦μL无菌症水1μ禁LRN泉as晴e，37白℃溶解豆质粒DN痒A。(三)实验帝结果辜及讨供论碱法有提取为质粒傲是实坊验室铅最常届用的慢质粒妹提取钳方法圣之一劣，提取相量较眨大，蕉便于黄操作。如有蛋白迅质残扎留，干浸燥后不透占明，而虏呈白胀色。附II：B型质洁粒小底样快刮速提亦取试容剂盒北京伪博大盟泰克访（Bi衫oD洁ev）生百物基处因技寒术有固限责先任公铅司(一)概述采用苗碱裂秆解--中和扒法，洋应用责常规咱台式丘高速奔离心还机，膊经反杜应条置件最挥优化都后，俊使含栗有质馅粒DN膨A的上轨清通此过设机计独抢特的离心到吸附哪柱式结构筑时，体被特殊志硅基蹦质材坟料高效踢、专意一地贩吸附青。被唐吸附泽的质竿粒DN痒A随后提可用洗脱艇缓冲厘液从离固心吸先附柱京上洗迟脱下千来。(二)试剂痕盒组唱成及扶包装ST在E缓冲蚊液(溶液1)Ly养si谦sBu病ff奋er察(溶液2)3浩MNa巴Ac,芦PH祥4祸.8耳(溶液3)结合泳缓冲顷液浓缩谜漂洗萝液洗脱平缓冲默液离心掉吸附蚁柱废液受收集牢管RN伐as关eA(1捕0m侍g/荐ml虾)(三)实验别准备试剂柔盒使解用前副，在5mL溶液1中加启入30卖0μ贷lRN肃as杜eA（RN钢as地eA终浓蜜度为0.早6m盐g/雾mL）。慕溶液1使用指完毕社后，惭立即勿于4踪蝶℃保存巩。浓缩捧漂洗辽液使用毫前按1：3的比绸例加寒入无水银乙醇，例财如15mL浓缩蜜漂洗纸液中碧加入45mL无水激乙醇乎，混峰匀后伐方可抚使用汇。实验盲前检免查溶液2及结合套缓冲测液是否隐有高株盐结艇晶。雹如有盾结晶箱，将唉盖拧认松后摄加热10棋-1愁5秒，忌高盐评结晶梨溶解迫后再府使用春。(四)实验润操作爸步骤收集1.落5-特3m叙L菌液搬的沉淘淀于1.翅5mLEp脚pe罗nf咸or搭f离心向管中从，加翁入10浩0μ昏l溶液1，振隶荡至梯彻底哪悬浮急。加入15兴0μl溶液2，立屿即轻浙柔颠担倒离档心管怪数次担，使抗菌体步充分秒裂解拴，裂汽解后毛的菌狭体变尊得清图亮。坑随后惜将离也心管笨放置狂于冰茅上1-枕2分钟冤（时硬间勿瞎超！践）。加入15雅0μl溶液3，立河即温发和颠钓倒离探心管久数次竞，室础温放危置5分钟其。12，00纠0r典pm离心12分钟润。将42贿0μ睬l结合瓣缓冲裕液加入辈离心抬吸附朴柱中湿，然奔后将抄步骤3中的雀上清忌加入网离心虑吸附家柱中骂（尽湖量去勺除杂鲁质）融，混群匀，12，00淘0r姥pm离心30秒钟筝。倒缸掉废歌液收彻集管片中的益废液猎。加入75窄0μl漂洗活液于离够心吸瘦附柱萝中，梦静置1分钟右，12，00者0r薯pm离心15秒。向倒掉宁废液仆收集康管中搞的废什液。重复坊一次。倒京掉废南液后辉，再次于12，00偷0r僚pm离心2分钟祸，尽演量除您去漂澡洗缓摔冲液使。下心奴取出嗽离心遍吸附萌柱，液将其贤套入享一个卖干净户的1.医5mLEp马pe早nd乒or补f离心蝇管中户，加略入洗脱货缓冲盒液，常脏规50丛μl，室干温放愿置2-由5分钟个，12，00宇0r捎pm离心1分钟烧。附II万I：H.县Q.巾&.醉Q.高纯拾度质谎粒微畜量试闪剂盒（HP识P石la淹sm批idMi虾ni遵pr放epKi肥t）A．样疯本制黑备将带舌有目抵的质险粒的E.咐c烧ol宏i接种掀于裝串有5m誓l伍LB佛/氨苄纪青霉债素(5割0μ交g/柏ml庆)培养暂基的10偷~2唉0m沉l培养闲管中喷，37域℃搖床鲁培养12哗~1辰6微hr，以扩增换质粒。建议份使用en槽dA敏感拳型的E.尖c兆ol答i菌株贩来作略常规味质粒则的分改离，益例如DH抖5α®和JM狭10擦9®等菌绵株。B．操现作方鸟案1.取1.竹5~朱5m熊l的菌锦液，犹于室端温下10献,0脏00部×g离心1m钓in以沉至淀菌恒种。2.倒出或吸慢出培日养基亿，弃家去。白往沉臂淀中妄加入25块0μ恳l的ZL啦-I／RN畏as迹eA混和任液，漩涡广振荡使细鸟胞完全微重新伴悬浮。细胞改沉淀叨的完全挡重悬对于乘获得高的盐产量是十达分重经要的愉。3.往重通悬混否和液配中加曾入25调0μ努lZL近-I蔑I，轻轻加翻转试管4~课6次混和能溶液报，以篮获得阻一澄清齐的裂死解液。如有扬必要哥，可需把裂洋解液愧置于额室温周静置2m泡in。避免暗剧烈扫混和展裂解广液，否滴则会闪使染拉色体DN但A断裂飘而使赌得到扎的质恰粒纯银度降不低。瞒当钥使用撑完ZL坟-I临I以后拼，须梨盖紧设其瓶锁盖保皇存好券。4.往上显述混晋和液架中加挥入35糕0μ圣lZL英-I羞II，并温和地上蚂下颠倒置离心蚀管数惰次，直爸至形装成白色覆絮狀她沉淀。于助室温刃下10份,0膝00榴×g离心10率mi理n。5.仔细取一声干净滑的Mu手-P岁u质粒熟微量少分离栏柱裝在灭一个2m慕l收集幼试管上(已备)。小心吸出奶上清担，并杠将其点转置土于柱拜子內篮，确板保转别至柱芹內的挑上清征中没有诉细胞傅杂质且沉淀。于匹室温匹下10队,0具00只×g离心1m钓in，使敌