DB35T 1218-2011马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程

ICS65.020ICS65.020B16DB35福建省地方标准DB35/T1218—2011马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程Technicalstandardforidentificationonthephysiologicalracesofphytophthora

infestansonpotato2011-12-31发布 2012-03-15实施福建省质量技术监督局发布DB35/T1218—2011DB35/T1218—2011IITOC\o"1-5"\h\z前言 II1范围 12术语和定义 13接种体的制备 13.1 培养基的配制 23.1.1黑麦培养基 23.1.2选择性培养基 23.1.3MS培养基 23.2晚疫病样的采集 23.3晚疫病菌的分离 2保湿培养分离法 2薯片夹叶分离法 23.4晚疫病菌的鉴定与纯化 23.5晚疫病菌的保存 26抱子囊悬浮液的制备 24鉴别寄主的保存与扩繁 31保存 34.2扩繁 35接种鉴定 31 接种方法 32 接种技术 35.3 接种后的培养 36病情调查 31调查时间 36.2病情调查方法 37生理小种确定 38鉴定后材料的灭活处理 4附录A（资料性附录）致病疫霉菌菌落培养特征及抱子囊形态特征 5附录B（规范性附录）植物水培标准营养液配方 ' 6附录C（规范性附录）马铃薯晚疫病菌生理小种命名方法 7DB35/T1218—2011DB35/T1218—2011,W, —1—冃IJ 言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则进行编写本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：李本金、陈庆河、翁启勇、兰成忠、赵健、邱荣洲。DB35/T1218—2011DB35/T1218—20113.6跑3.6跑子囊悬浮液的制备2DB35/T1218—2011DB35/T1218—20113接种体的制备3接种体的制备1马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程1范围本规程规定了马铃薯晚疫病菌生理小种室内鉴定的接种体的准备、鉴别寄主的保存与扩繁、接种鉴定、病情调查、生理小种确定、鉴定材料的灭活处理的方法。本规程适用于马铃薯晚疫病菌生理小种的室内鉴定。2术语和定义以下术语和定义适用于本标准。1人工接种鉴定Artificalinoculation在人工控制的条件下，用马铃薯晚疫病菌抱子囊接种到马铃薯鉴别寄主的离体叶片上，根据接种叶片的泡子囊产生状况确定菌株所属的具体生理小种。2.2接种体Inoculant用于人工接种鉴定用的马铃薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans 子囊悬浮液。2.3离体叶片接种法Leafinoculateinvitro用鉴别寄主植株中部复叶的小叶片接种的方法。2.4对照品种Contrastcultivar不含已知抗病基因的马铃薯感病品种（r）o2.5鉴别寄主Differentiatehost一套含有（R1〜R11）主效抗性单基因和对照的马铃薯品种。3.1培养基的配制3.1.1黑麦培养基将黑麦50g加适量去离子水浸泡36h,匀浆机捣碎，55°C〜60°C水浴1h〜2h,四层纱布过滤，上清液补水至1000mL,加入琼脂17g,121C高压灭菌25min。3.1.2选择性培养基在黑麦培养基中加入利福平20mg.L-1，氨卞青霉素200mg.LT,70%五氯硝基苯100mg.L-1。3.1.3MS培养基硝酸铵(NH4N03)1.65g,硝酸钾(KNO3)1.9g,氯化钙(CaCL.2H2。)0.44g,硫酸镁(MgSS7H2。)0.37g,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17g,碘化钾(KI)0.83mg,硼酸(H3BO3)6.2mg,硫酸锰(血$。4.4足0)22.3mg,硫酸锌(ZnSO4.7H20)8.6mg,钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)0.25mg,硫酸铜(前$。4.5足0)0.025mg,氯化钻(CoCl2.6H20)0.025mg,硫酸铁(FeSO4.7H20)27.8mg,乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)37.3mg,肌醇100.0mg,烟酸0.5mg,盐酸毗哆醇0.5mg,盐酸硫胺素0.5mg,甘氨酸2.0mg，蔗糖30g,琼脂7g,蒸馏水加至1000mL,消毒前调至pH5.8。3.2晩疫病样的采集在晚疫病发生或流行时期，采集具有典型症状的马铃薯晚疫病病叶，用保鲜袋或薯片夹叶带回实验室，贮放在18°C~20°C光照培养箱中备用。3晩疫病菌的分离3.3.1保湿培养分离法将采回的病叶用自来水冲洗干净，凉干后，叶背朝上放入培养皿内，18°C~20°C培养箱内保湿培养Id〜2d。挑取霉层置于选择性培养基上，18°C〜20°C培养7d~9d(菌落直径长至2cm〜3cm),备用。3.3.2薯片夹叶分离法取无可见症状的感病品种薯块清洗干净，晾干，用75%的乙醇溶液浸泡30s〜40s,取出，烧干表面残存的乙醇。将薯块切成约5mm厚的薯片，放在已灭菌的培养皿中。取用薯片夹病叶法采集的一小块病叶组织置于已消毒的两薯片之间，在18°C~20°C培养，待薯片长出霉层后，直接挑取霉层置于选择性培养基上，18°C~20°C培养7d~9d(菌落直径长至.〜3cm),备用。3.4晩疫病菌的鉴定与纯化挑取3.3分离的少量菌丝制成玻片，在100倍显微下观察諦体形态£一当菌体形态与附录A相符时，则确定所分离的病菌为致病疫霉菌。挑取致病疫霉菌的菌落边缘的单菌丝段，置于选择性培养基上，按3.3.1的培养条件进行培养。3.5晩疫病菌的保存纯化的晚疫病菌株转移到黑麦培养基培养，当培养基斜面上长满菌丝后，灌注灭菌过的液体石蜡密封，置于13°C黑暗中保存。DB35/T1218—2011DB35/T1218—201133将不携带抗病主效基因的新鲜马铃薯薯块按3.3.2的方法进行消毒。将在黑麦培养基上培养7d~10d的马铃薯晚疫病菌菌种接种在消毒薯片上，按3.3.2的方法进行培养。待薯片表面长满白色菌丝及抱子囊时，刮取薯片上的菌体放入装有3mL灭菌水的离心管中，振荡后配成抱子囊悬浮液，用2层纱布过滤收集抱子囊悬液。用血球计数板将抱子悬浮液的终浓度调配至每毫升约含5X104个抱子囊，置于4°C冰箱内处理2h〜3h诱导游动抱子释放，获取游动抱子悬液备用。游动抱子悬浮液应在使用当天制备。4鉴别寄主的保存与扩繁4.1保存鉴别寄主均应以脱毒试管苗进行保存，在无菌条件下，用MS培养基继代培养鉴别寄主。4.2扩繁将移植15d〜20d后的鉴别寄主试管苗扦插于以珍珠岩为基质的容器中，用植物水培营养液（见附录B）浇施，生长期温度控制在20C〜23C之间。约30d后采摘植株中部同叶龄健康复叶进行接种。5接种鉴定5.1接种方法采用离体叶片接种法。5.2接种技术在直径为9cm的培养皿中倒入灭菌后融化的1.5%水琼脂培养基30mL,待培养基凝固后，取鉴别寄主植株复叶的小叶片，背面朝上按编号摆放在培养皿内，用微量移液器吸取20HL3.6配制的游动抱子悬浮液，接种在每个小叶背面近中脉两侧。每个菌株设置3次重复，并以无菌水处理为对照。5.3接种后的培养将5.2接种后的叶片经17°C黑暗培养Id,将叶片翻转过来，在17°C~18°C的光照培养箱中按光：暗=16：8保湿培养。6病情调查6.1调查时间接种5〜7d后观察并记录病情。6.2病情调查方法用放大15倍的体视镜检查接种部位抱子囊的产生情况，当产生抱子囊的叶片判定为感病型，无产生抱子囊的叶片判定为抗病型。各处理的每个重复的叶片有3/4或以上为感病型，则该菌株对该寄主有毒力。若同一处理的3个重复的结果不一致视为无效处理。7生理小种确定DB35/T1218—2011DB35/T1218—2011DB35/T1218—2011DB35/T1218—2011根据供试菌株在以上鉴别寄主的抗（感）病型确定所属生理小种。各生理小种在鉴别寄主上的抗感病型模式见附录C8鉴定后材料的灭活处理将接种后剩余的接种体、接种鉴定后的植株残留物等集中到容器中经121°C、20min灭活处理。

附录A（资料性附录）致病疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征致病疫霉菌菌落为白色棉絮状（见图A1）。菌丝为无色、无隔膜。抱囊梗无色，具3-4分枝，在产生每个抱子囊的部位，抱囊梗膨大成节状，节基部钝圆而顶端尖细。抱子囊单胞无色，卵圆形，顶端有乳状突起（见图A2）。图A.1致病疫霉菌菌落形态DB35/T1218—2011DB35/T1218—2011附录B

(规范性附录)

植物水培标准营养液配方营养液配方：尿素5g、氯化钙(CaCL.2H20)0.56g、磷酸二氢钾(KH2PQ4)3.0g,硫酸镁(MgSO'.ZHzO)0.5g、硫酸锌(ZnSQ4.7H20)1.0mg、硫酸铁(FeSQ4.7H20)3.0mg,硫酸铜(CuSQ4.5H20)1.0mg,硫酸锰(MnSQ4.4H20)3.0mg,硼酸粉(H3BQ3)2.0mg,加纯净水10升，充分溶解后即成营养液。配制营养液的注意事项：配制营养液用玻璃、搪瓷、陶瓷等容器，切忌用金属容器。在配制时，应先用50°C〜60°C的少量纯净水分别溶化各种元素后，再倒入水中，边倒边搅拌，充分混合。调整营养液和酸碱度：纯净水用PH试纸测定为碱性时，应用磷酸来中和。如强酸性时，则滴加氢氧化钠中和，使之呈中性或微酸性。附录C

（规范性附录）

马铃薯晩疫病菌生理小种命名方法根据各供试菌株在11个含单基因（抗性基因）上的表现症状来进行马铃薯晚疫病病菌生理小种的命名，所有的生理小种均能侵染不具任何抗性基因的品种（r），如生理小种1.2.3.4,则表明该生理小种除了能侵染不具任何抗性基因的品种（r）夕卜，还可侵染Rl、R2、R3和R4,并表现出发病症状，而对R5、R6、R7、R8、R9、R10和R11均不能侵染，不能表现发病症状；如生理小种3.7