质粒提取定量与酶切鉴定

质粒DNA的提取、定量

与酶切鉴定ExtractionandIdentificationofPlasmidDNA实验流程图一、碱裂解法提取质粒三、质粒酶切二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做

掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握紫外吸收测定DNA的方法了解质粒酶切鉴定原理掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验材料大肠杆菌DH5a菌株pMD18-T载体易瑞质粒小量提取试剂盒TakaraEcoRI限制性内切酶TakaraHindIII限制性内切酶Takara10×M酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉0.5×TBE核酸电泳缓冲液EB核酸荧光染料Takara6×电泳上样缓冲液实验仪器微量移液器离心机恒温水浴箱紫外检测仪电泳仪水平电泳槽独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子基因工程常采用的载体一、碱裂解法提取质粒DNA碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；质粒DNA释放法；酸酚法等质粒提取方法：碱裂解法基本原理

基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。染色体DNA：氢键断裂，变性。质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。（不完全变性）质粒DNA：复性，溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成缠连的网状结构。pH=12.6（碱性）NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来离心pMD18-T溶液S1（细菌悬浮液）裂解液S2中和液S3洗涤液W洗脱液RNaseA(100mg/ml)DNA吸附柱试剂盒的组成：溶液S1：

50mmol/L葡萄糖

10mmol/L

EDTA 25mmol/LTris-HCl(pH8.0) 2毫克/毫升溶菌酶裂解液S2：200mmol/LNaOH 1%SDS中和液S3：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液1,取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，室温离心12000rpm×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2,加入250μl溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。3,加入250μl裂解液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），室温静置3min（不超过5min）。4,加入350μl中和液S3，立即温和颠倒6~8次混匀，至出现白色絮状沉淀。5，室温12000rpm离心10min。6,分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600μl，室温12000rpm离心30s，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。7,向吸附柱中加入600μl洗涤液W，12000rpm离心30s，弃滤液。8,重复步骤7一次。9,空柱10000rpm离心2min。10,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl56℃预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集洗脱液（即纯化的质粒DNA），-20℃保存备用。

实验流程1.5mL菌液12000rpm1min菌体沉淀溶液S1250μl剧烈震荡裂解液S2250μl颠倒混匀4-6次中和液S3350μl温和地颠倒混匀6-8次12，000rpm10min室温静置3~5min至出现白色絮状沉淀取600μl上清至吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗涤液W600μl12，000rpm30s12，000rpm2min取吸附柱至另一新EP管洗脱液50μl12，000rpm1min室温静置1min弃滤液空柱收集洗脱液备用洗涤液W600μl弃滤液弃滤液2.悬浮细胞1.收集细胞3.裂解细胞4.中和6.洗柱7.洗脱5.过柱分离加入洗脱液加入洗涤液W二、质粒DNA定量测定利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性基本原理紫外分光光度计操作补步骤取5l提取有的质蛙粒DN然A，加芳入95l蒸馏吩水混合速均匀3.用紫愧外分躲光光移度计蜂测定A26足0DN届A或RN士A的定缩慧量A26倾0=1改.0相当扛于50μg/团ml双链DN未A40μg/社ml单链DN女A（或RN狠A）20μg/诊ml寡核裂苷酸紫外零光吸蹦收法：DN艺A纯品:OD26锡0/O凉D28印0=刑1.民8RN垫A纯品:OD26势0/O馅D28部0=孤2.摔0DN乘A或RN烦A的纯宅度判劫定三、调质粒DN桌A的酶扬切分梢析质粒DN恰A:～3喷kb载体:谎pM弱D1探8-春T2.泪7k报b基因:胀CH翼D51.帮4杠kb限制签酶特荒异性女地结置合于己一段始被称饮为限制关酶识储别序制列的特布殊DN僻A序列另之内收或其改附近宴的特异想位点上，闹并在列此切割堤双链DN廊A。分子岁克隆脖中常易用的撤为II型限旷制酶似，其圈识别蔽位点喘长度闲为4～6个核挂苷酸走的反向桥重复象序列。限制场性内怨切酶GGATCCCCTAGGEc替oRⅠ和Hi扩nd纤Ⅲ的识赏别序放列和袄切口患是：Ec辆oRⅠ：G↓议AA史TT鬼CHi抹nd驴Ⅲ：A↓丹AG先CT朽TpM缎D1蚕8-猪T反应物

体积（µl)10×M酶切缓冲液2质粒DNA10HindIII1EcoRI1H2O

6在一剪个洁代净的1.接5狱ml离心促管中壤混匀姐下列槽反应振物：混合扒后37隆℃水浴1～2h质粒DN代A的酶葱切分季析操贪作1234影响旅酶切拘反应检的因露素底物DN蛋A的纯诉度反应铺系统景：(反应颂缓冲饭液)反应增体积荣：甘油炎浓度<5亭%保温衣时间威与温肯度四、蔑琼脂怕糖凝辉胶电换泳电泳音：带电多粒子烛在电袋场中虾泳动勾的现叶象影响浸迁移大率的忙因素亦？电场样品萝：大小局（分划子量社）形状虏（构叔型）电荷共价揭闭环育超螺奖旋DN坛A＞线性DN栏A＞开答环的辉双链谨环状DN箭A质粒DN心A三种枣构型披：共价梦闭环散超螺横旋线性开环货的双熟链环勺状琼脂浑糖凝木胶琼脂歌糖（Ag戒ar如os标e）是哪一种天多聚淹糖，美由半店乳糖贱及其该衍生肾物构久成的彼中性蜓物质常，不才带电怎荷。枪琼脂餐糖透塘明无沈紫外柔吸收，因此番，目迎前多危用琼徒脂糖尿为电染泳支烟持物境进行谜平板战电泳宅。胶浓度（％）线性DNA分子大小（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次冠电泳姜使用1.弃0%琼脂祸糖凝誉胶琼脂尽糖凝件胶浓厦度与DN亲A分子呜的有断效分狱离范桃围琼脂老糖凝神胶的猴制备上样坛：加样日前，授样品趴先与6×上样污缓冲拥液混之匀电泳：电压10叹0v；30惨mi美n结果嫩观察烟：凝胶邪成像盗仪琼脂乔糖凝翠胶电悔泳操调作琼脂胡糖凝追胶电浸泳1.凝胶宋准备①趴称1g琼脂批糖置正三角窑瓶中里，加0.粘5×拆TB鬼E序10缸0m棚l；②没微驰波炉屑加热瞒大约2分钟喊，熔吗化琼联脂糖涌；2.胶床骨准备①武将为梳子既垂直俯插入胸到胶杜床的叉小凹赞槽内在，梳咸齿底膨端和骡床面根有1m否m的间碌隙；②粉将秀胶床莲放在接调整赏好的插水平封台上凯；铺胶芬：将贷冷却箩至60位℃的凝北胶倒魔入准织备好送的胶抗床内昂，凝匹胶厚塔度约5握mm；室温雪下静亩置凝赶胶固门化。朋将带剃凝胶廊的胶现床置膀于电口泳槽害中，朝并使样品厅孔位笼于电可场负爸极；向电思泳槽我中加阁入0.德5×塞TB完E电泳计缓冲傻液，输越过极凝胶天表面法即可外；轻轻悟拔出斯固定铺在凝引胶中冰的梳好子；样品消准备前：向文核酸援样品宣中加搜入约扩为样让品体艰积1/猾6的上盘样缓腊冲液土，用趋加样万器轻吩轻混窑匀；上样死：用老加样逆器吸设取样花品，伟轻轻拢的加驴入到眠凝胶河的样老品孔截中，加样陕量为6µl；盖上忘电泳钱槽，考接通据电源争，开颂始电莲泳；电泳与条件耀：电洽压80邮v；时激间25～30分钟中；电泳陷结束带后，沉切断鲜电源与，取鸟出凝掌胶。电泳拼结果拾分析述：紫峡外检金测仪惰直接果观察阻电泳扔条带13傻.取出窗凝胶钥，置被于凝胶在成像挽仪中观磨察结田果，稍并拍汉照记踪蝶录。琼脂盏糖凝撒胶电碍泳上绩样1：DN馅A锐Ma耳rk跪er（5l）2：提贝取的球质粒DN秘A（5l）3：质萍粒DN光A酶切关产物（10l）+-1234每组察上2个样贩品DN榴A能Ma锦rk羽er暮(la晶dd降er普)Lo乐ad呀in效g肢Bu气ff涛er上样遥缓冲枕液ED丈TA甘油……肃……碑…增大编溶液田密度溴酚拥蓝……晋……指示吼剂二甲涨苯胺着蓝……指示抹剂组成0.吨5T璃BE忧,筹0.阁5-糊1.细4%浓度怒的胶愈中，迁移青率溴酚框蓝=3看00惕bp二甲辟苯胺闯蓝=4嫌kb擦p染色溴化疾乙锭(Et苦hi畏di耳um则B予ro葵mi叔de绣，EB):3枝,8吃-二氨睁基-5晋-乙基-6苯基牵菲啶腔溴盐闻，能钓插入DN沾A分子粪碱基混对之驱间并枝与之垒结合,在紫嘱外光钱照射心下呈妹现红掘橙