细胞增殖调控

细胞增殖调控第一页，共55页。一、MPF的发现及其作用MPF（maturation-/mitosis-/M-phase-promotingfactor）：即（卵细胞）成熟促进因子，或细胞有丝分裂促进因子，也称M期促进因子，在细胞周期调控中起重要作用。PCC（prematurechromosomecondensation）：即早熟染色体凝缩，主要是指与M期细胞融合的间期细胞（G1、S和G2）发生的形态各异的染色体凝缩。G1期PCC为细单线状（因DNA未复制），S期PCC为粉末状（因DNA由多个部位开始复制），G2期PCC为双线染色体状（说明DNA复制已完成），这样的形态变化可能与DNA复制状态有关。第二页，共55页。一、MPF的发现及其作用M期细胞中可能存在细胞有丝分裂促进因子：M期细胞可以诱导PCC，暗示在M期细胞中可能存在一种诱导染色体凝缩的因子，称为细胞有丝分裂促进因子（MPF）。第三页，共55页。M期细胞与G1（A）、S（B）和G2（C）期细胞融合诱导早熟染色体凝缩（PCC）（图14-1）第四页，共55页。成熟卵细胞细胞质移植发现成熟促进因子的存在：两位科学家分离出第Ⅳ期等待成熟的非洲爪蟾卵母细胞，并用孕酮进行体外刺激，诱导卵母细胞成熟，然后进行细胞质移植实验，他们发现，在成熟的卵细胞的细胞质中必然有一种物质可以诱导卵母细胞成熟，即成熟促进因子（MPF）；后来还证明，在成熟卵细胞中，MPF已经存在，只需通过翻译后修饰即可转化为活性状态的MPF。1998年分离获得了MPF：1998年，科学家们以非洲爪蟾卵为材料，分离获得了微克级的纯化MPF，并证明其主要含有p32和p45两种蛋白，并且是一种蛋白激酶。第五页，共55页。非洲爪蟾卵细胞成熟过程（Ⅰ~Ⅵ）、受精和第一次卵裂示意图（图14-2）第六页，共55页。成熟卵细胞细胞质移植发现成熟促进因子（MPF）的存在（图14-3）第七页，共55页。二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系（已知）非洲爪蟾卵：MPF＝p32

＋p45；MPF是激酶裂殖酵母：cdc2（基因）→p34cdc2（蛋白）p34cdc2激酶→调控G2/M转换；p34cdc2

＋p56cdc13。cdc即细胞分裂周期之缩写。芽殖酵母：cdc28（基因）→p34cdc28（蛋白）p34cdc28激酶→调控G1/S和G2/M转换；p34cdc28≈p34cdc2（同源物）。

p34cdc2≈p32（同源物）。海胆卵：含量随细胞周期进程变化而变化的蛋白质即周期蛋白（cyclin），cyclinB是MPF的另一种主要成分；cyclinB≈p56cdc13（同源物）。结论：MPF＝催化亚基单位（CDK）＋调节亚单位（Cyclin）。CDK为周期蛋白（cyclin）依赖性蛋白激酶第八页，共55页。三、周期蛋白周期蛋白（cyclin）：指含量随细胞周期进程变化而周期性变化的蛋白质，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个细胞周期中又重复这一消长现象。周期蛋白有多种：酵母中的周期蛋白有Cln1~3、Clb1~6；哺乳动物细胞中的周期蛋白A1~2、B1~3、C、D1~3、E1~2、F、G、H、L1~2、T1~2等。周期蛋白框（cyclinbox）：指所有周期蛋白中都存在的约由100个残基组成的相当保守的氨基酸序列，其功能是介导周期蛋白与CDK结合。第九页，共55页。三、周期蛋白破坏框/降解盒（destructionbox）：指M期周期蛋白近N端含有的一段由9个氨基酸残基组成的特殊序列（RXXLGXIGX），其功能是参与泛素依赖性的cyclinA和B的降解。在破坏框之后有一段约40个氨基酸残基组成的Lys（K）富集区。PEST序列：指G1期周期蛋白的C端含有的一段特殊的PEST氨基酸序列，其功能可能与G1期周期蛋白的更新（降解）有关。不同的Cyclin-CDK复合体表现不同的CDK活性：不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时相不同，并通过不同的周期蛋白框与不同的CDK结合，组成不同的cyclin-CDK复合体，表现出不同的CDK活性。第十页，共55页。周期蛋白含量随细胞周期的变化第十一页，共55页。部分周期蛋白分子结构特征（图14-4）第十二页，共55页。细胞周期蛋白的降解盒与降解途径第十三页，共55页。部分哺乳动物（A）和酵母细胞（B牙殖和C裂殖）周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK活性的关系（图14-5）第十四页，共55页。四、CDK和CDK抑制因子周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependentkinase,CDK）：由周期蛋白结合并活化的调控细胞周期进程的蛋白激酶。CDK通过磷酸化其底物而对细胞周期进行调控。CDK有多种：在人体中发现并命名的CDK包括CDK1（Cdc2）~CDK13。不同的CDK在细胞周期中起调节作用的时期不同。某些CDK与cyclin的配对关系及执行的功能的时期：见表14-1。CDK激酶结构域：各种CDK的CDK激酶结构域保守程度有所不同，但其中有一小段序列则相当保守，即PSTAIRE序列，与周期蛋白结合有关。第十五页，共55页。四、CDK和CDK抑制因子CDK的活性受磷酸化修饰调节：细胞内存在多种因子，对CDK分子结构进行磷酸化修饰，从而调节CDK的活性。CDK抑制蛋白（CDKinhibitor,CKI）：指对CDK起负调控作用的蛋白质，包括Cip/Kip家族和INK家族。①Cip/Kip家族：包括p21、p27和p57等，其中p21主要对G1期CDK（CDK2~4和CDK6）起抑制作用p21还与DNA聚合酶δ的辅助因子增殖细胞核抗原（PCNA）结合，抑制DNA的复制；②INK家族：包括p16、p15、p18和p19等，其中p16主要抑制CDK4和CDK6活性。第十六页，共55页。通过PCR技术测定与CDK1类似的CDK蛋白分子图解（图14-6）第十七页，共55页。第十八页，共55页。不同类型的周期蛋白激酶复合体脊椎动物芽殖酵母CyclinCDKCyclinCDKG1-CDKCyclinD*CDK2、4

、6Cln3CDK1(CDC28)G1/S-CDKCyclinECDK2Cln1、2CDK1(CDC28)S-CDKCyclinACDK2Clb5、6CDK1(CDC28)G2/M-CDKCyclinBCDK1(CDC2)Clb1-4CDK1(CDC28)第十九页，共55页。周期蛋白-周期蛋白依赖型激酶复合物在真核生物细胞周期调控中的作用

真核生物周期蛋白-周期蛋白依赖型激酶复合物在细胞周期调控中的作用G1G1-SSG2-M芽殖酵母Cln3-CDC28Cln1/2-CDC28Clb5/6-CDC28Clb1-4-CDC28裂殖酵母Cig1-CDC2Cig2-CDC2Cig2-CDC2Cdc13-CDC2脊椎动物CycD-CDK4/6CycE-CDK2CycA-CDK2CycA/B-CDK1植物CycD-CDKACycA-CDKACycA-CDKACycA/B-CDKACDC:细胞分裂周期蛋白第二十页，共55页。Cyclin的周期性变化第二十一页，共55页。植物细胞周期控制的图示

第二十二页，共55页。p21抑制作用的机理

第二十三页，共55页。五、细胞周期运转调控

细胞周期调控系统（cellcyclecontrolsystem）是指调节细胞周期运行的蛋白质网络系统。CDK因对细胞周期运行起着核心调控作用而被称为周期引擎分子。不同种类的周期蛋白与不同种类的CDK结合，构成不同的MPF。不同的MPF在细胞周期的不同时期表现活性，因而对细胞周期的不同时期进行调节。MPF又被称作细胞周期引擎。（一）G2/M期转化与CDK1的关键性调控作用（二）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转化（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK

（四）S/G2/M期转换与DNA复制检查点第二十四页，共55页。（一）G2/M期转化与CDK1的关键性调控作用CDK1活性依赖于cyclinB含量的积累：cyclinB（或cyclinA）的含量达到一定值并与CDK1结合，同时在其它一些因素的调节下，逐渐表现出最高激酶活性（G2/M期转换和M期启动）。CDK1催化底物蛋白磷酸化：CDK1通过使某些底物蛋白磷酸化，改变其下游的某些靶蛋白的结构和启动其功能，实现其调控细胞周期的作用。CDK1选择底物中某个特定序列中的某个Ser/Thr残基磷酸化。CDK1可以使多种底物蛋白磷酸化（见表14-2）。第二十五页，共55页。（一）G2/M期转化与CDK1的关键性调控作用CDK活性受到多种因素的综合调节：①周期蛋白与CDK结合只是激活CDK活性的先决条件：仅周期蛋白与CDK结合，并不能使CDK激活；②还需要其它几个步骤的修饰：cyclinB-CDK1复合物（无活性）→Wee1/mik1激酶和CDK1活化激酶（CAK）→cyclinB-CDK1的Thr14、Tyr15和Thr161磷酸化（无活性前体MPF）→cdc25C蛋白磷酸酶→cyclinB-CDK1仅剩Thr161磷酸化（有激酶活性的MPF）（MPF对cdc25C有正反馈作用）不同的CDK之间有一定的代偿功能；CDK对个体和器官的发育也起着重要的调节作用。第二十六页，共55页。cyclinB在CDK1活性调节过程中的作用（图14-7）第二十七页，共55页。第二十八页，共55页。CDK1激酶活性综合控制示意图（图14-8）第二十九页，共55页。活性MPF的正反馈第三十页，共55页。（二）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转化后期促进复合物（anaphase-promotingcomplex，APC）：20S，泛素连接酶（E3），通过泛素依赖性蛋白降解途径，降解M期周期蛋白和中期向后期转换的非周期蛋白类负调控因子，使细胞从中期向后期转换。APC至少由15种成分组成，分别称为APC1~APC15。APC的发现是细胞周期研究领域中又一重大进展，表明细胞分裂中期向后期转换也受到精密调控。APC的主要作用：到达分裂中期后，cyclinB/A与CDK1分离，在APC介导下，通过泛素化依赖途径而降解。CDK1活性消失，细胞由分裂中期向后期转化。第三十一页，共55页。（二）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转化APC活性受到多种因素的综合调节：①M期CDK激酶和蛋白磷酸酶对APC的活性起着调节作用；②纺锤体组装检查点调控APC的活性，如cdc20和Mad2（有丝分裂捕获缺陷蛋白2）分别为APC有效的正调控因子和负调控因子，在分裂中期之前，位于动粒上的Mad2与cdc20结合并抑制其活性。到分裂中期，Mad2从动粒上消失，解除对cdc20的抑制作用，促使APC活化，导致M期周期蛋白降解，M期CDK活性丧失。第三十二页，共55页。后期促进复合物（APC）作为有丝分裂的终结者第三十三页，共55页。马达蛋白和微管系统共同协作导致染色体分离第三十四页，共55页。CyclinB的降解途径第三十五页，共55页。（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK细胞由G1期向S期（G1/S期）转化主要受G1期周期蛋白依赖性CDK：cyclinD-CDK4/6、cyclinE-CDK2和cyclinA-CDK2。cyclinD-CDK4/6为细胞G1/S期转化所必需：cyclinD包括D1、D2和D3，它们的表达有细胞和组织特异性；cyclinD-CDK4/6的底物主要是Rb蛋白（retinoblastomaprotein）即成视网膜细胞瘤蛋白，Rb蛋白是E2F的抑制因子，E2F是促进与G1/S期转化和DNA复制有关的基因转录的转录因子，Rb蛋白在G1/S期转化中起负调控（“刹车”）作用，在G1期的晚期通过磷酸化而失活。第三十六页，共55页。（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDKcyclinE-CDK2为S期启动所必需：cyclinE-CDK2的主要作用是去除p107（类Rb蛋白）对E2F的抑制作用，促进G1/S期转化；cyclinE-CDK2是TGF-β的主要靶酶，TGF-β可以有效地抑制cyclinE-CDK2活性，进而将细胞阻止在G1期；cyclinE在肿瘤细胞中的含量比正常细胞中要高得多；在细胞中，提高cyclinE的表达，该细胞则快速进入S期，对生长因子的依赖性降低。cyclinA-CDK2也可以作用于p107（类Rb蛋白）：除此之外，cyclinA合成虽始于G1/S期转化时期，但cyclinA-CDK2却是S期主要的CDK。第三十七页，共55页。CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F第三十八页，共55页。p53和Rb在细胞周期调节中的作用

第三十九页，共55页。G1期周期蛋白是到达S期的一定阶段通过SCF泛素化途径降解的，同时需要G1期CDK的参与：SCF（Skp-cullin-F-boxprotein）（间期初级活化因子）是一种具有泛素连接酶（E3）功能的多亚基的蛋白复合物（Skp1、Cul1和Rbx1），可以被Skp2、β-Trcp或Fbw7三种F-box蛋白分别活化，而且SCF的底物特异性的识别是由F-box蛋白来决定的；SCF通过降解细胞周期的不同时期的不同的底物从而在整个细胞周期中都发挥作用（但主要在细胞间期G1、S和G2期发挥作用），如降解①

G1期周期蛋白（cyclinA、D1和E）（PEST序列对降解起促进作用），②CKI（p21、p27和p57），③DNA复制调控因子（ORC1和Cdt1）和④其它（cdc25a、Wee1和Emi1）。APC主要在M期和G1期早期发挥作用：APC的2个负责底物识别的因子是cdc20和Cdh1，APC催化的底物见图14-9。第四十页，共55页。间期初级活化因子（SCF）和后期促进复合物（APC）在细胞周期中的活动第四十一页，共55页。APC和SCF在细胞周期中的活性及其底物（图14-9）第四十二页，共55页。SCF泛素化依赖蛋白质降解途径（图14-10）第四十三页，共55页。其它对DNA复制起始活动进行综合调控的因素：DNA复制的起始并不仅仅是在G1期末的起始点（限制点）处才决定的。早在G1期开始时，许多与DNA复制有关的物质即已表达并与染色质结合，开始了DNA复制的起始调控。①ORC（复制起始点识别复合物）：ORC识别DNA复制起始点并与之结合，这是DNA复制起始所必需的；②cdc6和cdc45也是DNA复制所必需的调控因子：cdc6在G1期早期与染色质结合，到S期早期从染色质上解离下来；cdc45约在G1期晚期才与染色质结合，CDK6对cdc45于染色质的结合起促进作用；第四十四页，共55页。③DNA复制执照（licensing）因子—Mcm蛋白（minichromosomemantenanceprotein）：在M期，胞质中的执照因子Mcm蛋白（DNA解旋酶）与染色质接触并与之结合，使染色质获得DNA复制所必需的“执照”，但随着DNA复制进程“执照”信号会不断减弱直到消失，只有等到下一个M期重新获得“执照”，才能开始新一轮的DNA复制。DNA复制起始调控是近十年细胞周期调控研究中的又一大进展。第四十五页，共55页。ORC、cdc6、cdc45、CDK和Mcm与染色质的结合及其在DNA复制起始调控中的作用（图14-11）第四十六页，共55页。ORC、cdc6、cdc45、CDK和Mcm与染色质的结合及其在DNA复制起始调控中的作用（图14-11）第四十七页，共55页。（四）S/G2/M期转换与DNA复制检验点检查点（checkpoint）：细胞周期的调控点，检验细胞从一个周期时相进入下一个时相的条件是否适合。除CDK及其直接的活性调节因子外，还有不少其他因素参与细胞周期调控过程，如各种检查点等。各种检查点也有专门的调控机制。第四十