分子标记辅助育种-前沿讲座

分子标记辅助育种

Marker-assistedselection1目前一页\总数一百七十六页\编于十九点作物及猪、牛、羊等的驯化近代传统育种技术现代分子育种技术达尔文杂种优势理论孟德尔遗传规律分子生物学分子生物技术DNA双螺旋结构的发现遗传密码的破译古代育种技术粗放改良品种及杂交组合有性杂交自然和人工突变精确改良品种及杂交组合育种历史回顾：几千年百多年二十多年核心内容：创造变异和选择变异2目前二页\总数一百七十六页\编于十九点转基因途径相对传统育种法的优点传统育种法:相关的品种亚种种基因转移相关的品种亚种种转基因途径:动物

植物

噬菌体细菌

病毒

真菌

3目前三页\总数一百七十六页\编于十九点4目前四页\总数一百七十六页\编于十九点转Bt基因玉米的PCR检测结果转基因亲本的Southern检测结果1：MK；2：CK+，Bt质粒；3：CK-；4-13：转基因亲本5目前五页\总数一百七十六页\编于十九点分子育种学分子标记技术转基因技术常规育种技术经验、机遇科学、技术6目前六页\总数一百七十六页\编于十九点传统育种法:相关的品种亚种种基因转移相关的品种亚种种表型选择标记辅助选择:相关的品种亚种种基因转移相关的品种亚种种基因型选择由此可见，传统育种法和标记辅助选择法在本质上没有什么区别，但在选择效率和准确性方面，后者比前者大大提高。7目前七页\总数一百七十六页\编于十九点

项目传统回交育种标记辅助选择

变异来源有性杂交重组有性杂交重组

选择依据表型基因型+表型

适用性状主效基因性状主效+微效基因性状

标记类型形态和生化标记分子标记

背景选择粗放彻底

选择所需轮次4-6轮2-3轮

受环境条件影响大小

成本和技术低高传统回交育种与标记辅助选择方法的比较：8目前八页\总数一百七十六页\编于十九点第一节植物中常用的遗传标记(Geneticmarkers)什么是遗传标记?

遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。9目前九页\总数一百七十六页\编于十九点遗传标记类型:形态标记(morphologicalmarker）;细胞学标记(cytologicalmarker);生化标记(biochemicalmarker);分子标记(molecularmarker)。10目前十页\总数一百七十六页\编于十九点在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：多态性高；表现共显性；对农艺性状影响小；经济方便，容易观察记载。同时可以检测出显性和隐性基因等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记。11目前十一页\总数一百七十六页\编于十九点一、形态标记（morphologicalmarker）形态标记即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。形态标记简单直观、经济方便,长期以来，作物种质资源鉴定及育种材料的选择通常都是根据形态标记来进行的；据不完全统计，豌豆、水稻和番茄中已鉴定出上百个形态标记，棉花中已鉴定出160多个突变体表型；多个标记基因材料的培育，使多基因连锁分析时，可同时分析几个标记性状；例如，棉花多基因标记材料的发展；大量形态标记的发现，不仅为遗传研究提供了宝贵材料，而且为作物育种提供了大量显性标记，提高了选择效率。12目前十二页\总数一百七十六页\编于十九点水稻形态标记连锁图13目前十三页\总数一百七十六页\编于十九点T586T582基因符号标记性状基因符号标记性状R1红株d1丛生铃R2花瓣斑点v1牙黄Y1黄花瓣cu杯状叶T1密生茸毛fg窄卷苞叶P1黄花粉gl1无腺体-1N1光籽LC1棕色纤维L20鸡脚叶棉花多标记基因材料14目前十四页\总数一百七十六页\编于十九点利用形态标记进行辅助选择实例大麦中抗杆锈病的基因与抗散黑穗病的基因紧密连锁，因此，只要选择秆锈病的优良单株，也就同时选得了抗散黑穗病的大麦材料；棉花中有一种具有芽黄的雄性不育系，其芽黄标记基因与核雄性不育基因是共分离的。根据芽黄性状的有无在出苗后不久就可鉴别出不育株用于制种。它克服了一般情况下核雄性不育系需等到近开花期才能鉴别出可育株再拔除的缺陷，大大节省了育种成本，提高了育种效率；水稻中微效基因控制的优质性状和长粒特征连锁，选择长粒即可同时获得品质的改进。在大豆中，利用与产量密切相关的生育期、株高和结实期长短等性状间接选择遗传率低的产量性状，可以提高产量选择效率。15目前十五页\总数一百七十六页\编于十九点形态标记的缺点：在多数植物中形态标记的数量是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。

因此，形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。16目前十六页\总数一百七十六页\编于十九点二、细胞学标记(cytologicalmarker)细胞学标记即植物细胞染色体的变异，如染色体数目的的变化（单体、缺体、三体和四体等）和染色体结构变异（缺失、异位、倒位和重复等）。染色体数目的变化常常会引起某些表型性状的异常，这样就可以将染色体的变化用作为一种遗传标记。17目前十七页\总数一百七十六页\编于十九点通过染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）分析来测定基因所在的染色体及相对位置，也可通过染色体置换等进行基因定位。18目前十八页\总数一百七十六页\编于十九点作物遗传育种研究中已建立的细胞标记：番茄三体，烟草单体，玉米B-A易位系，水稻三体、易位系，小麦整套单体、端体以及缺体-四体，棉花易位系、单体等。这些标记在基因的染色体定位中发挥了重要作用。19目前十九页\总数一百七十六页\编于十九点20目前二十页\总数一百七十六页\编于十九点玉米矮花叶病抗病基因的定位21目前二十一页\总数一百七十六页\编于十九点应用实例在小麦中，利用小麦和黑麦杂交创造了1RS/1BL易位系，在1RS上携带抗锈病和抗白粉病等基因。根据1RS/1BL在小麦中不显现次缢痕，看不到随体和1RS特有的C带带型等细胞学证据，可判断后代是否携带有所需的来自黑麦的抗病基因即是否达到纯合。22目前二十二页\总数一百七十六页\编于十九点优缺点：与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但缺点是细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。23目前二十三页\总数一百七十六页\编于十九点三、生化标记(biochemicalmarker)1、生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶（Isoenzyme）是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，等位酶（Allelicenzyme）是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。2、同工酶标记为共显性遗传，杂合和纯合易于

区别，F2可完全分组。24目前二十四页\总数一百七十六页\编于十九点分析方法从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。25目前二十五页\总数一百七十六页\编于十九点玉米姊妹系和姊妹种的醇溶蛋白26目前二十六页\总数一百七十六页\编于十九点27目前二十七页\总数一百七十六页\编于十九点28目前二十八页\总数一百七十六页\编于十九点优缺点：与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但缺点是目前可使用的生化标记数量还相当有限，已鉴定出的具有多态性的作物同工酶位点约有80个，大多数作物不足30个。且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度。因此其实际应用受到一定限制。29目前二十九页\总数一百七十六页\编于十九点四、分子标记（Molecularmarkers）广义的分子标记也包括生化标记，即指可遗传并可检测的DNA序列及其产物，而狭义的分子标记仅指DNA标记。分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。生物各种性状的变异主要是遗传物质DNA差异造成的，因而通过DNA分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体的差异。30目前三十页\总数一百七十六页\编于十九点相对性状DNA序列的差异：1、单碱基突变2、插入突变3、缺失突变4、重复序列31目前三十一页\总数一百七十六页\编于十九点分子标记产生的基本原理32目前三十二页\总数一百七十六页\编于十九点分子标记产生的基本原理33目前三十三页\总数一百七十六页\编于十九点分子标记产生的基本原理34目前三十四页\总数一百七十六页\编于十九点与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；表现为中性，不影响目标性状的表达；许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。35目前三十五页\总数一百七十六页\编于十九点分子标记应用植物分子遗传图谱的构建；植物遗传多样性分析与种质鉴定；重要农艺性状基因定位与图位克隆；转基因植物鉴定；分子标记辅助选择等方面。36目前三十六页\总数一百七十六页\编于十九点37目前三十七页\总数一百七十六页\编于十九点38目前三十八页\总数一百七十六页\编于十九点39目前三十九页\总数一百七十六页\编于十九点40目前四十页\总数一百七十六页\编于十九点41目前四十一页\总数一百七十六页\编于十九点42目前四十二页\总数一百七十六页\编于十九点第二节分子标记的类型及原理DNA分子标记的基本原理主要是基于限制性内切酶酶切、PCR扩增或两者结合而获得的。分为三大类。43目前四十三页\总数一百七十六页\编于十九点第一类是以分子杂交为核心的分子标记限制性片段长度多态性标记（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,简称RFLP标

记）；DNA指纹技术（DNAFingerprinting）；可变数目串连重复序列标记（Variablenumberoftandemrepeats，简称VNTR标记）原位杂交（insituhybridization）等；44目前四十四页\总数一百七十六页\编于十九点第二类是以聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction,简称PCR反应）为核心的分子标记随机扩增多态性DNA标记（RandomamplificationpolymorphismDNA,简称RAPD标记）；简单序列重复标记（Simplesequencerepeat,简称SSR

标记）或简单序列长度多态性（Simplesequencelengthpolymorphism,简称SSLP标记）；扩展片段长度多态性标记（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,简称AFLP标记）、序标位（Sequencetaggedsites,简称STS标记）；序列特征化扩增区域（Sequencecharacteredamplifiedregion,简称SCAR标记）等。45目前四十五页\总数一百七十六页\编于十九点第三类是一些新型的分子标记单核苷酸多态性（Singlenuleotidepolymor-phism,简称SNP标记）；表达序列标签（Expressedsequencestags,

简称EST标记）等。反转录转座子标记（Retro-transposon）46目前四十六页\总数一百七十六页\编于十九点47目前四十七页\总数一百七十六页\编于十九点第三节分子标记在基因作图中的应用分子遗传学的发展，特别是分子标记技术的建立，为现

代遗传育种提供了全新的研究手段。分子标记的主要应用：

a构建分子遗传图谱

b比较基因组作图

c基因定位

d指纹分析

e图位克隆

f分子标记辅助选择

g杂种优势预测等48目前四十八页\总数一百七十六页\编于十九点一应用分子标记构建遗传图谱构建作物的遗传图谱，不仅是遗传研究的重要内容，而且为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定提供了理论依据。图谱类型:

遗传图谱和物理图谱49目前四十九页\总数一百七十六页\编于十九点遗传图谱和物理图谱

遗传图谱：通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图，又称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。物理图谱：指利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。

50目前五十页\总数一百七十六页\编于十九点遗传作图51目前五十一页\总数一百七十六页\编于十九点遗传作图基本原理：连锁分析孟德尔独立分配规律的要点是：各种配子基因型的比率是相等的（左图）；若出现亲本型配子的比率高于重组型配子，则说明基因间出现连锁（右图）。52目前五十二页\总数一百七十六页\编于十九点重组率和遗传图距重组率（r）的计算式为：

r重组型/(亲本型+重组型)

如又图例子:

r(76+75)/(542+537+76+75)0.1228

作图函数(mappingfunction)Haldane作图函数

r[1-exp(-0.02D)]/2Kosambi作图函数

r[1-exp(-0.04D)]/2[1+exp(-0.04D)]

式中: D=两基因间遗传图距图距单位:1cM(厘摩)=1%重组率;100cM=1M53目前五十三页\总数一百七十六页\编于十九点构建分子遗传图谱的基本程序亲本确定构建遗传作图群体筛选亲本间具有多态性的标记检测群体中每个个体的标记型分析数据，建立连锁群确定连锁群所属的染色体54目前五十四页\总数一百七十六页\编于十九点选择杂交亲本用于杂交的亲本必须是纯合的。亲本间必须有较远的

亲缘关系，以保证亲本间有较高的遗传差异（遗传多

态性），从而能够比较容易地筛选到足够数量的多态

标记；一般做法是，先挑选几个候选品种，随机选择一些探

针或引物，对它们进行RFLP或其它标记分析，然后根

据分析结果，选择多态性最高的一对品种做为亲本；但亲本间亲缘关系也不能太远，否则会影响F1的育性，

难以建立足够大的群体，并且可能造成后代严重的偏

分离现象，影响遗传作图的可靠性.55目前五十五页\总数一百七十六页\编于十九点建立遗传作图群体暂时性分离群体。BC1（回交一代）和F2是最常用的遗传作图群体，其优点是容易建立，速度快。其中BC1由于直接反映了F1配子的分离比例，因而在连锁统计分析上具有比F2更高的功效，准确性更高。但对于不易杂交的植物，采用F2更方便；永久性分离群体。RIL（重组自交系）和DH（加倍单倍体）也是较常用的群体，它们的优点是可以通过自交永久保持，所以特别适合于数量性状基因定位的研究。但建立这样的群体比较费时费工。56目前五十六页\总数一百七十六页\编于十九点筛选多态标记及群体标记型检测只有在双亲之间存在等位差异（多态性）的标记才会在杂交后代群体中发生分离，因而才能用于遗传作图。因此，在对群体进行分子标记分析之前，必须先筛选在双亲间表现出多态性的探针或引物。从双亲筛选到足够多的多态探针或引物后，即可对作图群体中的个体（或株系）进行标记型（marker-type）检测和记录。为了便于计算机分析，可以用数字来记录个体的标记型（电泳带型）。例如，将P1的标记型（亦即基因型AA）记为1，P2的（aa）记为2，F1（杂合Aa）的记为3。M1212121212121212121212121212M57目前五十七页\总数一百七十六页\编于十九点个体标记型记录示意图

下图显示3个RFLP标记的电泳带型。前3列分别为两个亲本和F1代，后面7列为F2代的一些个体。红色数字为带型的记录。P1带型记为1，P2带型记为2，F1带型记为3。可以看出，RFLP1和RFLP2在F2个体中的带型非常相似（仅4号个体不同），说明它们之间可能存在连锁；而它们与RFLP3的带型显然没有相关关系，因此与RFLP3没有连锁。RFLPmarker58目前五十八页\总数一百七十六页\编于十九点AFLP作图示例ABCDEF59目前五十九页\总数一百七十六页\编于十九点RAPDLane1andlane22DNAmarker,lane2Rf1bulked,lane3rf1bulk,lanes4–12fertileplants,lanes13–21sterileplants1234567891011121314151617181920212260目前六十页\总数一百七十六页\编于十九点CAPs61目前六十一页\总数一百七十六页\编于十九点分析标记数据，建立连锁群分子标记间的连锁分析方法与传统形态标记的连锁分析完全一样。唯一不同的是，这里分子遗传作图所涉及到的标记数目很多，所以计算上很复杂费时。通常先对所有标记进行两两间连锁分析，然后将它们归成不同的连锁群，进一步再通过多标记分析，确定各个连锁群中标记的排列顺序。目前已有很多专门的计算机软件用于分子遗传作图分析，常见的主要有Mapmaker/Exp和Joinmap。不同软件分析的结果可能不完全一样。62目前六十二页\总数一百七十六页\编于十九点确定连锁群与染色体的关系可以根据分子标记与已知所在染色体的传统形态标记间的连锁关系，确定分子标记连锁群属于哪条染色体；也可以利用非整倍体（如三体、单体）来确定分子标记所属的染色体。例如，水稻共有12种三体。可以用某个RFLP探针对所有12种三体进行严格定量的Southern杂交分析。由于三体比二体多一条染色体，因此，如果其中有一种三体的杂交信号强于其它11种，那么可以推断，该RFLP标记应该位于该三体染色体上；根据相似的道理，利用端三体等非整倍体，还可以进一步确定连锁群所在的染色体臂。63目前六十三页\总数一百七十六页\编于十九点水稻分子连锁遗传图（染色体1-6）64目前六十四页\总数一百七十六页\编于十九点水稻分子连锁遗传图（染色体7-12）65目前六十五页\总数一百七十六页\编于十九点二分子标记与比较基因组作图由于不同作物的染色体数、倍性及基因组大小相差较大，因此过去一般认为不同的物种间的基因图谱是各自独立、互不联系。研究对象往往仅是单一作物,缺乏相互间的比较;但随着分子标记技术（RFLP）的出现，科学家们逐渐发现不同禾本科作物的不同属间的染色体上的基因的内容和排列顺序存在很大的相似性;借助RFLP或同源序列比较，已经对禾本科作物（水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、黑麦）、茄科（番茄、马铃薯、辣椒）、十字花科（拟南芥、甘蓝、花椰菜、油菜）等物种进行了比较作图分析。66目前六十六页\总数一百七十六页\编于十九点几个重要的概念1、比较基因组学2、同线性与共线性67目前六十七页\总数一百七十六页\编于十九点1、比较基因组学(ComparativeGenomics)

比较基因组学(ComparativeGenomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。

68目前六十八页\总数一百七十六页\编于十九点2、同线性与共线性

同线性(synteny)是指一个物种某染色体或染色体片段上的两个或多个标记被定位于另一个物种的同源染色体上,

但这些标记间的相对顺序有时有变化。共线性(collinearity)则指同源染色体或染色体片段不仅其标记,

而且其标记间排列顺序都是保守的。

69目前六十九页\总数一百七十六页\编于十九点完全共线性(completecolinearity)(相似性)70目前七十页\总数一百七十六页\编于十九点由于染色体的易位，导致某一物种的特殊区域与另一物种的几个染色体区域存在共线性。71目前七十一页\总数一百七十六页\编于十九点二倍体和四倍体之间比较作图72目前七十二页\总数一百七十六页\编于十九点不同芸薹属作物之间的比较基因组作图，包括黑芥[(B.nigna)，BB基因组，N=8]、甘蓝[(B.oleracea)，CC基因组，N=9]、白菜[(B.rapa)，AA基因组，N=10]。主要是由于部分染色体的重排，打乱了三者之间的完全共线性。73目前七十三页\总数一百七十六页\编于十九点水稻、玉米、大麦、高粱及黍的比较基因组作图禾本科作物间的比较基因组作图表明：禾本科许多作物之间的差异不是由于功能基因的差别引起的，而是由于大量的重复序列差异引起的。不同作物间部分同源关系的研究不仅在作物起源演化研究上具有重要意义，而且在分子标记育种和基因克隆等方面也有重要作用。74目前七十四页\总数一百七十六页\编于十九点三、分子标记与基因定位基因定位：将具有某一表现型性状的基因（主效/微效）或与该基因相关的标记定位在遗传连锁图或相应的染色体上，称为基因定位（又称遗传作图）。基因定位的关键环节：根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体群体中不同植株的标记基因型的分析；标记间连锁群的确定。75目前七十五页\总数一百七十六页\编于十九点（一）、质量性状的定位质量性状：受主效基因控制，在表型上呈非连续性变异的性状，如抗病性、抗虫性、育性及一些抗逆性等。常用作图群体：

1、回交群体（backcross

population）

2、F2群体（F2population）

3、近等基因系（Near-isogeniclines，NIL)76目前七十六页\总数一百七十六页\编于十九点水稻抗除草剂基因定位-ssr标记/F2群体注意：选用隐性纯合体做作图群体，以被免因显性纯合体和杂合体在表型上无法区分，而造成交换个体无法在基因型上被准确判断的困难。77目前七十七页\总数一百七十六页\编于十九点RM49RM1861.8RM550.6RM1688.5MRG49243.3RM4161.7AC8878a1.7AC2823a0.3bel0.1AC2827a0.4RM38671.2MRG10041.60.0定位结果78目前七十八页\总数一百七十六页\编于十九点不育系综3恢复系87－1不育胞质恢复型豫玉22质量性状定位79目前七十九页\总数一百七十六页\编于十九点质量基因定位的分离群体1、F2群体Cms-C(rf4rf4)×N(Rf4Rf4)F1Cms-C(Rf4rf4)F21Cms-C(Rf4Rf4)2Cms-C(Rf4rf4)1Cms-C(rf4rf4)80目前八十页\总数一百七十六页\编于十九点质量基因定位的分离群体2、BC1群体Cms-C(rf4rf4)×N(Rf4Rf4)Cms-C(rf4rf4)×Cms-C(Rf4rf4)BC11Cms-C(Rf4rf4)1Cms-C(rf4rf4)81目前八十一页\总数一百七十六页\编于十九点质量基因定位的分离群体3、NILs群体82目前八十二页\总数一百七十六页\编于十九点质量性状基因的初步定位——BSA分群法(分离体分组混合分析法

)

在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与感病），将个体或株系分成两组，然后分别将两组中的个体或株系的DNA混合，形成相对的DNA池。根据亲本与DNA池扩增带型之间的差异，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。83目前八十三页\总数一百七十六页\编于十九点

可以推测，这两个DNA池之间除了在目标基因座所在的染色体区域的DNA组成上存在差异之外，来自基因组其它部分的DNA组成是完全相同的，都是该作图群体基因库的一个随机样本。84目前八十四页\总数一百七十六页\编于十九点BSA分群的基本原理85目前八十五页\总数一百七十六页\编于十九点抗病单株感病单株基于性状表现型的BSA法86目前八十六页\总数一百七十六页\编于十九点抗病单株感病单株P1P2F2RF2S87目前八十七页\总数一百七十六页\编于十九点抗病单株感病单株P1P2F2RF2S88目前八十八页\总数一百七十六页\编于十九点

在F2群体中，对于5cM的区间，当混合体所含个体数不超过40时，双交换概率小于10%。当目标区间增大到10cM时，混合个体数必须小于10，才能保持10%的双交换概率。

Goivannoni等建议混合体所含个体数应大于5，目标区间的长度应小于15cM。混合群体的单株个数89目前八十九页\总数一百七十六页\编于十九点P1P2F2FF2s玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf5SSR分子标记的筛选90目前九十页\总数一百七十六页\编于十九点分离群体的基因型判断与相应的分子标记数据的处理1、分离群体的标记数据2、依据表型推断每一分离群体的单株基因型1）BC1群体：如果抗病亲本为1，感病亲本为2；在BC1群体中抗病单株为3，感病单株为2。2）F2群体：如果抗病亲本为1，感病亲本为2；在F2群体中感病单株为2，抗病单株可能为3或1，因此利用F2的表型不能推知其基因型，所要利用F3群体判断F2的基因型。91目前九十一页\总数一百七十六页\编于十九点交换值的计算

原理：根据单株基因型与标记数据，利用三点测验或两点测验计算目标基因与连锁标记之间的交换值，然后利用Kosambi作图函数进行校正：

常用的统计软件有：Jointmap和Mapmaker92目前九十二页\总数一百七十六页\编于十九点Cms-CMo17（rf4rf4rf5rf5)×凤可1（Rf4Rf4Rf5Rf5)Cms-CMo17×F1BC1F23:115:1

玉米C型胞质雄性不育的恢复存在两对重叠恢复主基因例：玉米C型胞质雄性不育恢复基因的定位93目前九十三页\总数一百七十六页\编于十九点玉米C型胞质雄性不育恢复基因定位94目前九十四页\总数一百七十六页\编于十九点玉米温敏核雄性不育系琼68的育性受一对隐性基因控制琼68×K12琼68×F1BC1F2可育：不育1：13：1

umc1185phi08317.5nc13314.9umc23807.7umc156012.4umc14976.1umc24023.1umc21294.6TM3/tm33.7umc10421.5phi25137.7bnlg13293.5bnlg15204.7phi32818912.4umc19477.9umc152524.9bnlg207711.2bnlg18935.7phi10104916.3phi03923.0玉米温敏核雄性不育基因TMS3/tms3的遗传连锁图95目前九十五页\总数一百七十六页\编于十九点质量性状基因的精细定位——NILs法96目前九十六页\总数一百七十六页\编于十九点Cms-El（rf4rf4）×Cms-El(Rf4Rf4)恢复基因Rf4的精细定位Cms-C(rf4rf4)×Cms-C(Rf4rf4)BC11Cms-C(Rf4rf4)1Cms-C(rf4rf4)10000株分离群体利用87-1背景的恢复基因Rf4的NILs97目前九十七页\总数一百七十六页\编于十九点(二)、数量性状基因的定位

大多数重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点,如产量性状、成熟期、品质、抗旱性等。这类性状受多基因位点(QuantitativeTraitLoci，QTL)和环境共同决定的98目前九十八页\总数一百七十六页\编于十九点QTL定位是通过数量性状观察值与标记间的关联分析，即当标记与特定性状连锁时，不同标记基因型个体的表现值存在差异，来确定各个数量性状位点在染色体的位置、效应，甚至各个QTL间的相互作用。99目前九十九页\总数一百七十六页\编于十九点QTL定位方法根据个体分组依据不同，将QTL定位方法分成两类：基于性状的分析法。基于标记的分析方法。100目前一百页\总数一百七十六页\编于十九点1.基于性状的分析法将分离群体按某一数量性状表现型值分为两个极端组，如果一个标记与QTL连锁，那么该标记与QTL间会发生一定程度的共分离，其基因型分离比例在两组中都会偏离孟德尔规律，通过卡平方测验可以推断该标记是否与QTL连锁。该方法的缺点是只能用于单个性状的QTL定位，且灵敏度和精确度均较低，一般只对效应较大的QTL有效。101目前一百零一页\总数一百七十六页\编于十九点2.基于标记的分析方法

如果某标记与QTL连锁，分离群体中该标记与QTL间会发生一定程度的共分离，那么，该标记的不同基因型数量性状表现型值会出现差异，即可推测该标记与QTL的连锁关系。其主要的代表性模型包括：单标记分析法、区间作图法等102目前一百零二页\总数一百七十六页\编于十九点单标记分析法通过t测验、方差分析、回归分析、似然比测验或最大似然估计，比较某一标记不同基因型数量性状表现型均值间的差异，如果差异显著，则说明控制数量性状的QTL与该标记连锁，进而估算其效应前三种方法只能检测标记是否与QTL连锁，却无法估计它们间的重组率。最大似然法虽然可以把参数估计和连锁检测合为一体，但存在以下几个缺点：不能确定标记是与一个QTL还是与几个QTL连锁；无法估计QTL的可能位置；由于遗传效应与重组率混合在一起，导致QTL效应值的偏估计；容易出现假阳性，且检测效率不高。单标记分析法的优点是不需要完整的标记连锁图。103目前一百零三页\总数一百七十六页\编于十九点区间作图法：建立在个体数量性状观测值与双测标记基因型变量的线性模型的基础上的一种QTL定位方法，它利用最大似然法对相邻标记构成的区间内任意一点可能存在的QTL进行似然比检测，进而获得其效应的极大似然估计缺点是需要构建分子标记连锁图104目前一百零四页\总数一百七十六页\编于十九点示例1105目前一百零五页\总数一百七十六页\编于十九点示例2106目前一百零六页\总数一百七十六页\编于十九点107目前一百零七页\总数一百七十六页\编于十九点

复合区间作图法，由于多元回归中表型对标记的偏回归系数只取决于两个相邻标记所包括区间存在的QTL，与其它区间的QTL无关，因此在简单回归分析之后选择多个可能的标记作为前景干扰进行分析，求出特定QTL与性状间的偏回归系数来判断QTL是否存在。此法添加了背景控制，使一个区间的测定不受定义区间以外的其它标记和QTL影响，减小了剩余方差，提高了QTL的检测能力（Zeng，1993；1994）。复合区间作图法108目前一百零八页\总数一百七十六页\编于十九点基于混合线性模型的复合区间作图法

朱军等（1998）提出了基于混合线性模型的复合区间作图法，利用随机效应的预测方法获得基因型效应及基因型与环境互作效应的预测值，然后再用复合区间作图法分别进行遗传主效应及基因型×环境互作效应的QTL分析。该方法把群体均值、QTL遗传主效应（包括加性效应、显性效应和上位性效应）作为固定效应，而把环境效应、QTL与环境互作效应、分子标记效应及其与环境的互作效应以及剩余方差作为随机效应，将效应估计和定位分析结合起来，进行多环境下的联合QTL定位分析，提高了作图的精度与效率。109目前一百零九页\总数一百七十六页\编于十九点常用的QTL作图软件

目前QTL定位过程中广泛使用的软件有：MAPMAKER/QTL1.1、QTLmapper1.0、QTLmapper1.6、QTLmapper2.0、Jointmap、Qgene2.29、QTLcarttographer等。110目前一百一十页\总数一百七十六页\编于十九点影响QTL作图精度的主要因子QTL作图精度一般包括QTL的发现能力、位置和效应估计的准确程度等。同时,QTL作图一般要经过世代分离、标记检测、数量性状值测定和统计分析等多个环节,因而QTL作图精度会受到许多因素的影响。111目前一百一十一页\总数一百七十六页\编于十九点

何小红等(2001)认为：(1)在QTL发现能力上，适当大标记密度较有利于QTL的检测,过大或过小都不利；随着遗传力提高和样本容量变大发现QTL能力提高，但效率下降。如QTL的遗传力为10%，标记间距15cM，则样本容量300就可保证QTL的发现能力达80%以上。(2)只要标记间距不过大，一般来说，一旦QTL能被检测到，则其位置和效应的估计也较准确，其位置估计值的95%置信区间绝大多数在20cM之内。112目前一百一十二页\总数一百七十六页\编于十九点Chr.2Chr.1Chr.3Chr.4Chr.5113目前一百一十三页\总数一百七十六页\编于十九点Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10QTLdetectedforgrainyieldQTLdetectedforearlengthQTLdetectedforkernelsweightQTLdetectedforrownumberNote:114目前一百一十四页\总数一百七十六页\编于十九点115目前一百一十五页\总数一百七十六页\编于十九点分子标记辅助选择116目前一百一十六页\总数一百七十六页\编于十九点第四节分子标记技术在作物育种中的应用一、分子标记辅助选择（marker-assistedselection,MAS）的遗传基础和应具备的条件遗传基础以RFLP标记辅助选择抗病基因(R)为例：标记基因型 P1…M P2…m F1…Mm F2…MMMmmm在MM群体中大多数个体由于连锁携带抗基因R，若重组值为P，当基因纯合时，则

RR概率为(1—P)2 Rr概率为2P（1—P）

rr概率为仅为P2即重组值越小，其错选率越低P1P2xMRMRmrmr_–MRmr_–F1F2MRMRMRmrmrmr__–RRRrrr×117目前一百一十七页\总数一百七十六页\编于十九点

利用MAS的遗传基础×MRmr供体受体目标基因与DNA标记间的遗传距离为p一一mr一一亲本中DNA标记的带型F1杂种中DNA标记的带型一一一一MR在F2分离群体中分子标记类型，即MM、Mm和mm型118目前一百一十八页\总数一百七十六页\编于十九点

在分子标记为MM群体中，大多数个体由于连锁应携带该抗病基因R，若重组值为p，其基因型纯合时，即RR的概率为（1-p）2，杂合基因型Rr的概率为2p（1-p），而错选率rr仅为p2。119目前一百一十九页\总数一百七十六页\编于十九点2.MAS的基本条件分子标记与目标基因的遗传距离应是共分离或紧密连锁（一般要小于5cM才能有效用于MAS）简便快捷的DNA自动化提取方法及检测方法。所用分子标记类型最好是PCR标记；检测技术在不同的实验室或研究者间应有很高的重复性，且经济实用；最好有一套能准确进行数据分子的统计软件。

120目前一百二十页\总数一百七十六页\编于十九点二、进行MAS育种的限制因素及改进措施

1.限制因素作物基因作图的速度还相当缓慢，分子标记与目标性状间的遗传距离仍较大，不符合MAS的要求；直接交给育种家使用的PCR为基础的标记还不多，已筛选出的标记在不同遗传背景下不稳定；还缺乏真正意义上的低成本、高效率、操作简便的标记检测体系；部分研究人员的知识结构不合理，植物育种家与分子遗传学家之间的有机结合、相互沟通不够。121目前一百二十一页\总数一百七十六页\编于十九点2.降低成本办法

发展和应用DNA微量快速提取技术，只要能提取DNA，尽量使用廉价药品；减少PCR反应体积，如从每管25µl，减少到15-10µl；琼脂糖凝胶可反复多次使用，EB染胶观察可在反应管中直接进行；改EB染色为甲烯篮染色，该UV观察为可见光观察，减少人体伤害。122目前一百二十二页\总数一百七十六页\编于十九点

夏军红等（2002）利用分子标记对玉米S胞质雄性不育的恢复基因Rf3进行回交选择，在HSBC1F1群体中，通过一代标记辅助选择，可育单株遗传背景与轮回亲本最高相似程度已达到83.9%；在MYBC3F1群体中，通过一代表型选择和两代MAS，可育单株遗传背景与轮回亲本最高相似程度已达到98%。MAS应用实例123目前一百二十三页\总数一百七十六页\编于十九点

Stuber等（1995）利用MAS将决定玉米高产的主效基因从自交系TX303转移到B73，OH43转移到Mo17，育成的新自交系“增强B73”和“增强Mo17”，二者配制的杂交种较对照增产15%。124目前一百二十四页\总数一百七十六页\编于十九点

研究表明，在一个有100个个体的回交后代群体中，借助100个RFLP标记选择，只需3代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的99.2％，而利用常规回交转育的方法则需要选择7代才能达到，大大缩短了育种时间。125目前一百二十五页\总数一百七十六页\编于十九点三、提高分子标记的筛选效率（一）、多重PCR法（二）、相斥相分子标记选择法（三）、选用与目标性状紧密连锁的分子标记126目前一百二十六页\总数一百七十六页\编于十九点（一）、多重PCR法

技术原理：即利用多对引物在同一反应条件下同时进行PCR扩增。应用条件：多个以PCR反应为基础的分子标记与目标性状紧密连锁；各个分子标记的扩增产物具有不同分子量大小；各引物的复性温度必须相匹配；Taq酶量与一个引物用量必须相同。优点：降低成本，节约筛选时间，提高选择效率。127目前一百二十七页\总数一百七十六页\编于十九点实例：如Ribaut等将筛选到的与热带玉米抗旱有关的QTL连锁的1个STS和两个SSR标记进行多重扩增用于MAS选择，以改良耐旱性。两人仅用了一个月时间就从BC2F1的2300个单株中选出300个目标单株。128目前一百二十八页\总数一百七十六页\编于十九点（二）、相斥相分子标记选择法技术原理：即利用与目标性状相斥连锁的分子标记进行辅助选择。所谓相斥连锁即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。适用范围：在显性标记如RAPD、AFLP、STS、ISSR上应用效果特别显著。原因：通过相斥标记的选择，可将群体中含标记的不含目标性状的纯合体和含目标性状的杂合体植株全部剔除，仅剩下无标记的含目标性状的植株。优点：若筛选的分子标记与目标性状紧密连锁，中选的成功率将大大提高。129目前一百二十九页\总数一百七十六页\编于十九点实例：如Haley(等1994）找到与菜豆普通花叶病毒隐性抗病基因bc-3连锁的两个RAPD分子标记，其中标记-1与bc-3相引，距离为1.9cM;标记-2与bc-3相斥,距离为7.1cM。利用标记-1进行群体选择时,含标记-1中选植株中,纯合抗病株、杂合体和纯合感病株分别占26.3%、 72.5%和1.2%;而利用标记-2进行群体选择时,含标记-2中选植株中, 纯合抗病株、杂合体和纯合感病株分别占81.8%、18.2%和0%。当将两个标记同时使用时，其选择效果与单独使用标记-2的效果一致。 一般认为，在育种早代选择中，利用相斥相的RAPD标记，与共显性的RFLP标记具有相似的选择效果。130目前一百三十页\总数一百七十六页\编于十九点（三）、选用与目标性状紧密连锁的分子标记如利用目标性状左右两侧1cM之内的分子标记只需2个世代就能从分离群体中找到供体DNA片段最小但携带有目标基因的个体；而传统的方法可能需要8-15代才能办到。通过紧密连锁的分子标记进行辅助选择还可克服传统回交育种过程中的连锁累赘（Linkagedrag）问题。所谓遗传累赘即目标性状与不良性状紧密连锁，并一起导入受体基因组，导致改良的品种与预期目标不一致的现象。131目前一百三十一页\总数一百七十六页\编于十九点四、MAS技术在育种程序中的应用（一）、MAS技术在回交育种程序中的应用I、利用MAS对目标性状进行回交转育的两个基本过程II、利用MAS技术进行回交转育的基本程序132目前一百三十二页\总数一百七十六页\编于十九点I、利用MAS对目标性状进行回交转育的两个基本过程：针对目标基因进行间接选择；针对供体亲本进行遗传背景清除或针对轮回亲本进行遗传背景恢复。133目前一百三十三页\总数一百七十六页\编于十九点134目前一百三十四页\总数一百七十六页\编于十九点II、利用MAS技术进行回交转育的基本程序1、合适分子标记的选择2、亲本多态性筛选3、目标性状的间接选择4、轮回亲本的遗传背景的恢复135目前一百三十五页\总数一百七十六页\编于十九点1、合适分子标记的选择

针对目标基因进行间接选择的分子标记，只要与目标基因紧密连锁，原则上可选用任何一种分子标记进行，但以易于检测、重演性好的为佳，如SSR，AFLP，RFLP等。针对供体亲本进行遗传背景清除的分子标记，最好是选择以PCR反应为基础的易于检测，且多态性高的分子标记，如RAPD、SSR和AFLP等136目前一百三十六页\总数一百七十六页\编于十九点2、亲本多态性筛选

这是MAS过程中最关键也最为重要的一环。一般来说，针对供体亲本进行遗传背景清除，需要有250个左右能覆盖全基因组的有多态性的分子标记（见左图），并在每条染色体上均匀地分布，具体数目可以随基因组大小的不同而有所差异；杂交亲本间分子标记多态性频率的高低主要与所用亲本的亲缘关系远近有关。双亲亲缘关系远的，其分子标记的多态性频率就高，反之亦然。具体筛选时是逐条染色体均匀地进行，直到所需要的量为止。137目前一百三十七页\总数一百七十六页\编于十九点变异系数标记数量当群体大小一定时，采用不同数量的标记所求得的遗传背景恢复率变异系数是不同的，所采用的标记数量越多，通过分子标记所计算出的群体遗传背景回复率越准确，其变异系数越小。当达到250个以后，其变异系数就基本上不再变化。138目前一百三十八页\总数一百七十六页\编于十九点3、目标性状的间接选择执行世代：除F1以外的全部转育世代选择依据：紧密连锁139目前一百三十九页\总数一百七十六页\编于十九点4、轮回亲本的遗传背景恢复执行世代：BC1F1至BC2F1或BC3F1选择目标：99.99%140目前一百四十页\总数一百七十六页\编于十九点141目前一百四十一页\总数一百七十六页\编于十九点III、分子标记辅助的回交育种模式图

待改良亲本含有目标基因的供体亲本待改良亲本F1

待改良亲本BC1F1（PCR分析选阳性单株，AFLP分析 选待改良亲本遗传背景最多者）待改良亲本BC2F1（PCR分析选阳性单株，AFLP分析选 待改良亲本遗传背景最多者）

BC3F1

（PCR分析选双交换阳性单株）

BC3F2（PCR分析选目标改良体）目标改良体的繁殖、鉴定与推广142目前一百四十二页\总数一百七十六页\编于十九点（二）、MAS技术在杂交育种程序中的应用与目标性状紧密连锁分子标记的筛选自F2代开始，针对目标性状进行连续2-3代的间接选择；农艺性状的综合选育与评价143目前一百四十三页\总数一百七十六页\编于十九点五、MAS技术在作物育种程序中成功应用的实例（一）、目标质量性状的选择例1 明恢63IRBB21

明恢63F1

明恢63BC1F1（标记248的PCR分析和白叶枯病菌株ZJ173接种 鉴定选择到49个抗性单株，标记AB89的PCR分 析选择到1株单交换的抗性单株）明恢63BC2F1（标记248的PCR分析和白叶枯病菌株ZJ173接种鉴 定选择到180个抗性单株，标记C189的PCR分析选择 到1株单交换的抗性单株）

BC3F1

（标记248的PCR分析和128个RFLP标记分析从250个抗性 单株中选择到2株除Xa21区段以外的遗传背景全为明恢63 的抗性单株）

BC3F2（标记248的PCR分析选择到Xa21基因纯合的单株）改良型明恢63的繁殖、鉴定与杂种生产单个基因转育明恢63的抗病性改良配合力测定、抗性鉴定和产量比较试验144目前一百四十四页\总数一百七十六页\编于十九点

将多个基因利用分子标记辅助选择的方法，整合到一个新的材料中，从而创造一个含有多个有利基因的新材料或自交系的方法。

基因聚合145目前一百四十五页\总数一百七十六页\编于十九点（一）、目标质量性状的选择例2：水稻白叶枯病有许多个生理小种，而不同的生理小种的抗病表现型是相同的。要区分某一个体中所携带的对某个白叶病菌生理小种的抗性基因，必须通过分小种隔离接种鉴定的方法才能确定。这不仅技术要求高、消耗人力和时间，而且局限于在高世代稳定品系鉴定时使用，对早代分离群体中的单株选择鉴定很难进行。借助分子标记，可以先在不同亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个品种中去，通过检测与不同基因连锁的分子标记来推断该个体是否含有相应的基因，以达到聚合选择的目的。 国际水稻所的黄宁等人（1998）利用分子标记技术已将抗白叶枯病基因xa5、Xa4、xa13和Xa21精确定位，并通过聚合杂交、分子标记辅助选择获得4个抗白叶枯病基因垒集到IR24的同一个单株中。多个基因垒集146目前一百四十六页\总数一百七十六页\编于十九点（一）、目标质量性状的选择例3：高产、优质、抗病性状间存在负相关，MAS可有效打破这种负相关。 南京农业大学棉花育种研究室（1998）利用洞A核雄性不育系拓建了我国抗黄枯萎病品种的轮回选择基础群体，并将抗病、抗虫、高产、优质等不同品系与该群体杂交，利用MAS快速获得了高产、优质、抗病虫的棉花新品系。例4：不同的转基因性状可通过MAS技术快速地综合到一起

Thiet等人（2002）曾将转化的抗白叶枯病Xa21基因与抗鳞翅目害虫的Bt基因综合到IR72的遗传背景中。打破目标性状间的负相关147目前一百四十七页\总数一百七十六页\编于十九点（二）、QTL(QuantitativeTraitLocus)的选择作物的许多重要农艺性状大多由数量性状基因控制，通过QTL分析，可寻找出决定QTL的主效基因紧密连锁的分子标记用于MAS。目前，已筛选到许多与QTL紧密连锁的分子标记，如植物耐旱性、成熟度、株高、种子大小、子粒硬度、种子油份、蛋白质含量、可溶性固体物质含量以及产量等。Stuber等（1995）利用分子标记技术将决定玉米高产的主效基因从自交系TX303转移到B73中，从自交系OH43中转移到MO17中，育成了新自交系“增强B73”和“增强MO17”，二者配制的杂交种在两年的实验中，较对照增产15%。148目前一百四十八页\总数一百七十六页\编于十九点影响准确辅助选择QTL的因素：

育种群体大小环境基因型性状遗传率149目前一百四十九页\总数一百七十六页\编于十九点六、用于MAS的育种策略（一）针对质量性状的分子标记辅助选择，主要应用回交育种法；（二）将作物重要农艺性状分析与新品种培育结合起来，QTL分析放在回交高世代进行；（三）在大群体范围内应用单目标分子标记辅助选择（Singlelarge-Scalemarker-assistedselectionSLS-MAS）（四）将MAS与常规育种结合起来150目前一百五十页\总数一百七十六页\编于十九点1、基本原理（1）首先利用分子标记辅助选择目标性状，并尽可能使群体足够大，使中选的植株具有纯合的目标位点；（2）同时，在其它位点上保持有较大的遗传多样性，最好仍成孟德尔分离。这样，分子标记筛选后，仍有遗传多样性丰富的群体供育种家通过传统育种方法选择，产生新的品种和杂交种。（三）单目标分子标记辅助选择151目前一百五十一页\总数一百七十六页\编于十九点2、基本步骤（1）利用传统方法结合DNA指纹图谱选择具有目标性状的基因；（2）确定某重要农艺性状QTL标记；（3）结合筛选的QTL标记，对上述分离群体中的单株进行SLS-MAS；（4）根据标记的有无选择目标材料。（三）单目标分子标记辅助选择152目前一百五十二页\总数一百七十六页\编于十九点七、分子标记用于作物遗传多样性