L新型发酵技术制药

4微生物工程制药4.1微生物发酵制药的基本方法4.2抗生素4.3微生物产生的生理活性物质4.4微生物制药的质量控制

目前一页\总数六十五页\编于十四点4.1微生物发酵基本方法发酵原料预处理灭菌

淀粉制糖，培养基配制，间歇灭菌，连续灭菌，无菌过滤)无菌空气制备：粗滤，过滤(过滤介质的选用)菌种扩大培养斜面菌种，摇瓶种子，种子罐发酵及控制(发酵参数检测及反馈控制)固态发酵：三角瓶，浅盘，池式通风固态发酵，固体发酵罐液态发酵：厌氧发酵：如啤酒，黄酒，葡萄酒发酵通风发酵：机械搅拌式，气升式(氨基酸，抗生素等)半固态发酵发酵类型：间歇式，流加式，连续式流加：碳源，氮源，其它物质的流加目前二页\总数六十五页\编于十四点生物药品，提取工艺流程的基本模式发酵或培养（培养基预过滤和无菌过滤，空气无菌过滤，尾气过滤）

预处理(加热、调pH、絮凝)

细胞灭活处理

细胞分离(沉降、离心、过滤)

上清液（含胞外产品）

细胞 细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）

细胞碎片分离（离心分离、萃取、过滤）

收集上清液或包涵体

初步纯化（沉淀、吸附、萃取、超滤）

高度纯化（层析、离交、亲和、疏水、吸附、电泳）

成品加工（无菌过滤、超滤、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶目前三页\总数六十五页\编于十四点4.2抗生素4.2.1抗生素的分类4.2.2抗生素药物的命名4.2.3抗生素的生产方法4.2.4几种抗生素的介绍4.2.5抗生素筛选的新方法目前四页\总数六十五页\编于十四点4.2.1抗生素的分类A：根据抗生素的化学结构分共有八类:β-内酰胺类四环类环内酯类多烯大环类多肽类苯烃基胺类蒽环类其它类目前五页\总数六十五页\编于十四点内酰胺类抗生素主核目前六页\总数六十五页\编于十四点四环素目前七页\总数六十五页\编于十四点B：根据抗生素的作用对象分类抗细菌，抗真菌，抗肿瘤等抗细菌抗生素(又可细分为抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，广谱)杆菌肽(bacitraacin)头胞霉素(Cephalosporins)氯霉素(Chloramphenicol)金霉素(Chlotetracycline)环丝氨酸霉素(Cycloserine)红霉素(Erythromycin)庆大霉素(Gentamycin)卡那霉素(Kanamycins)青紫霉素(Lividomycin)林可霉素(Lincomycin)麦迪霉素(Mydemycin)新霉素(Neomycin)新生霉素(Novobiocin)竹机霉素(Oleandomycin)土霉素(Oxytetracycline)青霉素(+)(Penicillin)利福霉素(Rifamycins)核糖霉素(Ribostamycin)多粘霉素(-)(Polymycin)相模霉素(Sagamicin)四环霉素(Tetracycline)万古霉素(Vancomycin)短杆菌素(Tyrothricins)链霉素(-)目前八页\总数六十五页\编于十四点抗真菌抗生素两性霉素B(AmphotericinB)杀假丝菌素(Candicidins)灰黄霉素(Griseofulvin)制菌霉素(Nystatin)

抗肿瘤抗生素放线菌素(Actinomycins)光辉霉素(Mithramycin)丝裂霉素(Mitomycin)肉瘤毒素((Sarkomycin)目前九页\总数六十五页\编于十四点抗生素杀菌作用的机制目前十页\总数六十五页\编于十四点4.2.2抗生素药物的命名没有统一规则；常用的命名法有：根据生产菌命名：在产生菌的生物学属名或种名后加上“霉素”或“菌素”；如：青霉素，头孢菌素。按照化学结构与性质命名：多用于化学结构明确的抗生素：按发现产生菌的地名命名：如西伯利亚霉素；菲律宾霉素等；按作用对象命名：制癌菌素，制霉菌素，抗真菌素；其它：如用发现单位的名称；目前十一页\总数六十五页\编于十四点4.2.3抗生素的生产方法（1）

微生物发酵法（2）化学合成法，少数抗生素如氯霉素等，也可以用此法生产。（3）半合成法，将发酵法制得的抗生素用化学、生物或生化方法进行分子结构改造而制成各种衍生物，称为半合成抗生素，如氨苄青霉素(Ampicillin)目前十二页\总数六十五页\编于十四点4.2.4几种抗生素的介绍（一）-内酰胺类抗生素(二)大环内酯类抗生素（三）四环素（四）氨基糖苷类抗生素（五）多肽类抗生素

目前十三页\总数六十五页\编于十四点（一）-内酰胺类抗生素-内酰胺类抗生素是分子中含有-内酰胺环的一类天然和半合成抗生素的总称。成为目前品种最多、使用最广泛的一类抗生素。特点：毒性在已知抗生素中最低，容易进行化学改造，并可产生一系列高效、广谱、抗耐药菌的半合成抗生素，具有良好的药物学性质，目前十四页\总数六十五页\编于十四点（1）核心结构：β–内酰胺环四原子内酰胺环的抗生素目前十五页\总数六十五页\编于十四点（2）青霉素及其衍生物青霉素G的基本结构是由-内酰胺环和噻唑烷环骈联组成的N-酰基-6-氨基青霉烷酸。当发酵培养基中不加侧链前体物时，能产生多种N-酰基取代的青霉素混合物，青霉素钠盐（注射用为主）；别名：苄青霉素，青霉素G。苄基青霉素钠盐。分子式：C16H17O4N2SNa，

分子量：356.36主要抑制细菌细胞壁的合成，为繁殖期杀菌型抗生素，主要对G＋菌有效，目前十六页\总数六十五页\编于十四点（3）青霉素杀菌的作用机制抑制细菌细胞壁的合成目前十七页\总数六十五页\编于十四点青霉素杀菌作用机制青霉素和粘肽的末端结构类似取代粘肽的D-Ala-D-Ala，竞争性地和酶活性中心以共价键结合构成不可逆的抑制作用目前十八页\总数六十五页\编于十四点（4）主要的-内酰胺类抗生素临床应用的-内酰胺类抗生素分为：青霉素；头孢菌素；新型-内酰胺。它们绝大多数都是由天然-内酰胺抗生素用半合成法得到，其中青霉素和头孢菌素是天然-内酰胺类抗生素的代表。目前十九页\总数六十五页\编于十四点（5）青霉素的生产液态通风发酵法目前二十页\总数六十五页\编于十四点青霉菌目前二十一页\总数六十五页\编于十四点青霉素发酵生产的一般流程

冷冻干燥孢子，产黄青霉菌（Pen.Chrysogenum)⇂琼脂斜面

⇂米孢子

⇂补料种子罐碳源、氮源、前体⇁→

⇂←消泡剂发酵罐

⇂过滤

⇂青霉素回收菌丝体⇂

综合利用目前二十二页\总数六十五页\编于十四点(6)半合成抗生素通过结构改造–增加稳定性–降低毒副作用–扩大抗菌谱–减少耐药性–改善生物利用度–提高治疗效力目前二十三页\总数六十五页\编于十四点例：6－氨基青霉烷酸

（6-aminopenicillanicacid,6-APA)半合成青霉素的原料目前二十四页\总数六十五页\编于十四点（7）天然头孢菌素从顶头孢霉菌（Cephalosporiumacremonium)获得，对阳性和阴性菌均有作用。分子式：C16H20N3NaO8S，分子量：437；主要由发酵法生产，由氨基己二酸，半胱氨酸和缬氨酸为原料。典型的天然头孢菌素为头孢菌素C和7-甲氧头孢菌素C(头霉素C)，都具有广谱的抗细菌作用，对青霉素酶稳定，头霉素C还能耐头孢霉素酶。由于天然的头孢菌素抗菌活性不高或抗菌谱不理想，有过敏反应，对酸不稳定，容易产生耐药性等，临床上应用的都是它们的半合成衍生物，如口服头孢力新、头孢克罗；注射用头孢唑啉、目前二十五页\总数六十五页\编于十四点头孢霉素目前二十六页\总数六十五页\编于十四点(二)大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素是以一个大环内酯环(亦称糖苷配基)为母核，通过糖苷键与糖分子相连接的一类化合物。根据大环内酯环的结构，可分为大环内酯抗生素(亦称非多烯大环内酯抗生素)和多烯大环内酯抗生素。一般大环内酯分为一内酯与多内酯。常见的一内酯有：十二元环大环内酯类抗生素(如酒霉素等)、十四元环大环内酯类抗生素(如红霉素等)和十六元环大环内酯类抗生素(如柱晶白霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素及交沙霉素等)，至今最大者已达六十元环，如具有抗肿瘤作用的醌酯霉素A1，A2，B1。多内酯中二内酯有：抗细菌与真菌的抗霉素、稻瘟霉素、洋橄榄霉素、硼霉素等。

主要是抑制蛋白质合成的快速抑菌剂，如红霉素。氮红霉素类。目前二十七页\总数六十五页\编于十四点例：大环内酯类：埃博霉素的分子结构目前二十八页\总数六十五页\编于十四点目前二十九页\总数六十五页\编于十四点大环内酯类抗生素分类14元环大环内酯类天然：红霉素半合成：克拉霉素，罗红霉素15元环大环内酯类半合成：阿奇霉素16元环大环内酯类天然：乙酰螺旋霉素，麦迪霉素，交沙霉素半合成：罗他霉素目前三十页\总数六十五页\编于十四点（三）四环素链霉属不同菌种生产。半合成法生产。主要作用机制：抑制细菌肽链的增长和蛋白质的合成。可引起细菌细胞膜通透性改变，从而抑制DNA的复制四环素，土霉素，金霉素目前三十一页\总数六十五页\编于十四点（四）氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素是由氨基环醇与氨基糖通过氧桥连接而成的苷类抗生素，抑制蛋白质合成，静止期杀菌性抗生素。链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素等目前三十二页\总数六十五页\编于十四点链霉素（streptomycin）链霉素是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。1943年美国S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。抗结核杆菌有特效作用。链霉素由灰链霉菌发酵。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。

目前三十三页\总数六十五页\编于十四点（五）多肽类抗生素（AMP）

antimicrobialpeptidespeptideantibiotics

多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，一般具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。

多肽类抗生素是抗生素中最大的一个类群，共有1000余种，包括所有氨基酸型、肽型和蛋白质型以及它们的杂环化合物。多肽抗生素可由基因编码，在核糖体上合成的多肽抗生素。多肽抗生素也可在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质的抗生素，如杆菌肽、多粘菌素E、短杆菌肽S

目前三十四页\总数六十五页\编于十四点（六）放线菌素D(actinomycinD)放线菌素D是从浅藤黄链霉菌(S.luteoiutescens)所分离出来的多组分放线菌素的混合物。目前三十五页\总数六十五页\编于十四点放线菌素D的生产工艺流程

目前三十六页\总数六十五页\编于十四点目前三十七页\总数六十五页\编于十四点（七）抗病毒抗生素1990年至1999年，报道新发现了200多种抗病毒抗生素。三分之二为抗HIV化合物，大部分毒性大，未能开发。结构多样性。以核苷类，醌类及大环内酯类的抗病毒抗生素较多。也包括糖苷类及芳香族衍生物类。目前三十八页\总数六十五页\编于十四点4.2.5抗生素筛选的新方法抗生素的筛选流程通常包括以下三个步骤：(1)分离和培养生物体；(2)抗生素的检测；(3)抗生素物质的化学描述及结构鉴定。由于能够产生新型抗生素的放线菌的生活范围相当广泛，直到20世纪6o年代中期，不需要复杂的方法便能分离到这些菌株。•当时的筛选流程通常是依赖有效的工厂式的操作，微生物学家在筛选过程中根据生产菌株的形态学和它们的抗菌谱挑选分离出许多链霉菌用来生产抗生素和作为可能产生新的抗生素的候选者，然后抗生素物质被提纯、描述和鉴定。然而，随着天然产生的抗生素的数量不断增加，发现新的抗生素已变得越来越困难。因此，创新筛选新抗生素的方法势在必行。

目前三十九页\总数六十五页\编于十四点(一)稀有放线菌作为筛选资源

直到1974年，放线菌来源的抗生素几乎都是由链霉菌产生的(在大约2000种抗生素中，约95％的抗生素是由链霉菌产生的)。在以后的6年中，由稀有放线菌产生的抗生素约占放线菌来源的1100种抗生素的25％.因此，作为抗生素来源的稀有放线菌的作用变得越来越重要。目前四十页\总数六十五页\编于十四点稀有放线菌通常是以较小的数量存在于土壤的微环境里，为了提高它们的分离几率，选择压(抗生素)的使用已取得了良好效果。在缺少选择压的培养基里，一些长得较快的普通微生物体会长满整个平板。例如，游动放线菌属通常对新生霉素有抵抗性而对NaCL却很敏感，因此可以在加入新生霉素以抑制其它微生物生长的平板上将其分离出来。许多放线菌显示出对很多抗生素的多重抗性。例如

在缺少氨基糖苷的培养基里，很难将抗这种抗生素的放线菌分离出来。然而，在培养基里一旦加入了氨基糖苷抗生素，敏感微生物的生长就被抑制，结果，只有抗氨基糖苷的微生物才能够生长，这些抗生素的生物体包含大量不同的放线菌，其中一些是新抗生素的产生菌。目前四十一页\总数六十五页\编于十四点(二)靶标定向筛选

随着发现新抗生素几率的下降和应用于临床上的抗生素的活性基团得到确认，关于将抗生素的特异基团作为靶标的各种不同筛选序已被建立起来。这些程序主要依靠对靶标抗生素比如8-内酰

胺的鉴别检测。目前四十二页\总数六十五页\编于十四点总的靶标定向筛选过程包括靶标定向分离和生物体的选择。这种筛选过程要与靶标定向检测结合起来才能够增大发现新靶位抗生素的几率。定向分离的对氨基糖苷有抗性的放线菌揭示了几个有趣的事实。在分类上，不同的具有多重氨基糖苷抗性的放线菌广泛地分布在自然界中。此外，这种对一定氨基糖苷有不同抗性的模式在使用缺少氨基糖苷抗生素的培养基来分离放线菌时却看不到这一现象。使用一种或多种类型的氨基糖苷抗生素能显著提高一系列抗氨基糖苷抗生素的放线菌的分离几率。进一步对氨基糖苷的抗性和氨基糖苷的生产力的研究揭示了抗氨基糖苷的放线菌产生抗生素的能力要显著地高于对氨基糖苷敏感的放线菌。实际上抗性越广泛，产生抗生素的可能性也就越高。抗性的模式在个体之间及与其它放线菌菌种之间能区别出来。因此不同的氨基糖苷抗性模式对于产生不同的抗生素是一种信号或表型标记。换句话说，新抗生素的抗性模式被看作是新抗生素产生菌的表型标记。

目前四十三页\总数六十五页\编于十四点在糖胎的定向筛选程序中放线菌株是在含有糖胎类产品的培养基中分离得到的。用不同的抑制手段检查糖胎抗生素的产生，比如使用万古霉素来抑制Staphylococusaurecs的生长和使用diacty-L-ly-syl-D-alanyl-D-alanine作为糖胎抗生素的受体的一种特异性的抗性筛选。总的来说这种糖胎定向筛选方法产生了不同类别的产糖胎抗生素的放线菌，在1936个培养物中得到了44个，筛选几率为2．2％。值得注意的是，发现新糖胎抗生素的几率仅为O．3％。

通过作用于病毒、真菌和肿瘤来探测抗生素活性的许多筛选方法已经发展起来了。这些筛选方法主要是根据靶标生物体或细胞的形态、新陈代谢和生理特点，从小的方面讲是根据靶标抗生素的作用机制而建立起来的。目前四十四页\总数六十五页\编于十四点(三)使用特殊培养基和培养条件

放线菌通常在不同的天然液体培养基中，并且在27—28℃，180～259rpm／分钟的条件下生产抗生素。大部分培养基由碳源(如甘油、葡萄糖、淀粉)、氮源(如硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、大豆粉)、无机磷酸盐、阳离子(如Ca一、Mg一、Na)和微量元素(如Co、Cu、Fe、Mn、Zn)等组成。因为生产抗生素的调节机制千差万别，所以没有任何一种培养基能够适合于所有类型的抗生素的生产。因此，为了筛选不同的抗生素应该使用不同成分的培养基。一定类型的培养基适合于一定类型的抗生素的产生，例如，当放线菌在富培养与贫培养的条件下检查抗生素的生产力时发现了aplasmomycin。在富培养条件下放线菌产生其它菌株，不能产生aplasmomycin，但在被稀释了l6倍的贫培养基上却能产生此抗生素。冷霉素是S．griseus耐寒性的亚种在018~C培养条件下发现的。大多数的链霉菌在特殊的培养条件下不能产生抗生素，但是，如果在这种环境条件下能够产生抗生素，那么发现新抗生素的可能性是相当高的。

目前四十五页\总数六十五页\编于十四点(四)海洋微生物是新型生物活性物质和新抗生素先导化合物的来源海洋微生物不仅能产生新型的生物活性化合物，而且还能产生一些由陆栖微生物所产生的有应用价值的抗生素。例如从海洋链霉菌-鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种的代谢产物中，不仅发现了新抗生素8510，而且也发现了肌醇胺霉素和春日霉素]目前四十六页\总数六十五页\编于十四点(五)高通量筛选

高通量药物筛选是近10年来国际药业研究发展过程中一门新兴技术，它已经被世界各大医药公司广泛用于药物先导物的筛选。我们通常所说的高通量药物筛选平台是由化合物库、靶体选择、靶体和化合物反应的测试方法的建立、靶体作用物的高通量筛选和数据的信息处理系统这几大部分组成。目前四十七页\总数六十五页\编于十四点目的是通过对种类繁多的化合物作针对各种药物靶体的筛选，从中寻找最佳的先导化合物，进而用于新型药物的开发。其特点是规模大、速度快、成本相对较低，缩短新药开发周期并可找到最佳新药。化合物活性筛选是创新药物研究的起点和具有决定意义的阶段，是源头创新和持续创新的关键。分子生物学和分子药理学的研究成果阐明了许多在生命活动中起着十分重要作用的生物大分子如酶、受体和离子通道等与疾病之间的关系。这些生物大分子逐步取代传统的药物筛选方法，发展成为药物初筛的主要靶标。据报道，迄今已发现药物靶点483个，其中45％为受体，28％为酶，5％为离子通道。随着人类基因组学、蛋白质组学和生物信息学研究的进展，成百上千个与疾病密切相关的分子靶点将被认识，并将开发成为药物筛选的新模型。目前四十八页\总数六十五页\编于十四点(六)从极端环境微生物中筛选新抗生素

近年来，极端环境微生物被认为是新抗生素的宝贵来源之一，尽管它们产生的抗生素还不多。极端环境微生物能够产生很多的化学物质。它们大部分没有什么明显作用，但在偶然情况下从中可以发现具有很高生物活性的物质。实际上，这种产生多样化学物质的能力肯定能够提高微生物体产生稀有化合物的新抗生素的几率。一些研究人员认为嗜盐微生物产生抗生素的能力要高于其它的极端环境微生物。目前四十九页\总数六十五页\编于十四点4.3微生物产生的生理活性物质本节主要内容4.3.1生理活性物质的命名和分类4.3.2微生物产生的酶抑制剂目前五十页\总数六十五页\编于十四点生理活性物质的定义微生物发酵产生的，抗生素以外的具有各种各样药用生理活性物质，有的已成为药物，但大部分只是作为药物先导化合物或作为生化试剂。12000余种天然活性物质被发现。应用的约200多种；种类增加趋势明显。生理活性物质合成或半合成产物的研究也方兴未艾目前五十一页\总数六十五页\编于十四点生理调节和控制的三个层次整体水平：通过神经系统的激素调节；

器官，组织和细胞水平：主要是体液调控；具体表现为互相隔离，互相联系，分工协作。

分子水平：表现为信息传递和信息反应，以酶，受体等为中心的调控系统。人体的许多生理活动都由酶来调节。故靶酶很多，有希望作为药物的酶抑制剂的种类也很多，但关键是要对发病的代谢调控机理有清楚的了解。才能设计出好的酶抑制剂筛选模型。目前五十二页\总数六十五页\编于十四点4.3.1生理活性物质的命名和分类生理活性物质的命名：根据产生菌或产生菌发现地点命名；根据化学结构或性质命名；根据作用对象命名；以“抗”字为字头（anti-pain，抗痛素)以“抑”字为字头或以“抑素”，“他丁（-tatin）”为字尾抑甘露糖苷酶素，糜蛋白酶抑素；洛伐他丁；目前五十三页\总数六十五页\编于十四点生理活物质的分类（1）酶抑制剂，诱导剂，激活剂。（2）生物应答调节剂免疫调节剂：免疫增强剂、免疫抑制剂；其它细胞功能调节剂：增强剂（如血液细胞分化促进剂）、（3）作用于受体的物质：受体拮抗剂；受体激动剂

（4）其它药理活性物质：作用于神经系统的物质

（5）作用于脏器的物质；抗组胺物质；与炎症有关的物质；激素样物质目前五十四页\总数六十五页\编于十四点4.3.2微生物酶抑制剂日本科学家H.Umezawa首先提出：以特定的酶作为靶点，从微生物的代谢产物中寻找酶的抑制剂。得到具有调节生理功能的物质。近代药物作用机制研究也证实，许多已知药物就是一些特殊酶的抑制剂。目前五十五页\总数六十五页\编于十四点几类重要的酶抑制剂三高症：高血脂，高血糖，高血压代谢障碍所引起的疾病。（1）糖代谢相关酶抑制剂糖尿病及有关的酶抑制剂（2）脂质代谢相关酶抑制剂高血脂症及相关的酶抑制剂（3）蛋白质、肽及氨基酸代谢相关酶抑制剂（4）其它酶抑制剂目前五十六页\总数六十五页\编于十四点4.3.2.1糖代谢相关酶抑制剂糖代谢酶根据其功能分为：糖苷酶与淀粉酶类：（与碳水化合物消化有关）。此类酶的抑制剂包括：糖苷水解酶及淀粉酶抑制剂；醛糖还原酶抑制剂；半乳糖苷酶抑制剂及甘露醇酶抑制剂；此类酶的抑制剂可望作为肥胖症，动脉粥样硬化，糖尿病，高脂血症等的药物；存在于细胞表面的糖蛋白：此类糖代谢酶与免疫应答，发炎，细胞融合，补体结合，癌变，癌细胞转移以及病毒感染等过程有关；此类酶的抑制剂有可能用于抗艾滋病毒的感染和控制肿瘤细胞转移。目前五十七页\总数六十五页\编于十四点4.3.2.2脂质代谢相关酶抑制剂分类：（1）脂肪（酸）合成酶抑制剂：脂肪酸合成酶抑制剂：抑制脂肪酸的合成，使脂肪没有原料。（2）脂肪酶抑制剂：抑制脂肪的合成或分解。上述两者都与减肥有关。（3）胆固醇合成