ISO方法学评估概述

ISO15189:方法学评估概述李志付2014-08-18

目前一页\总数六十页\编于十四点CNAS中国合格评定国家认可委员会(ChinaNationalAccreditationServiceforConformityAssessment):是根据《中华人民共和国认证认可条例》的规定，由国家认证认可监督管理委员会批准设立并授权的国家认可机构，统一负责对认证机构、实验室和检查机构等相关机构的认可工作。目前二页\总数六十页\编于十四点基于国际要求的实验室认可认可体系建立依据的标准：ISO/IEC17011《合格评定机构认可机构通用要求》ILAC（国际实验室认可合作组织）、APLAC的要求（亚太实验室认可合作组织）的要求认可活动依据的标准:ISO/IEC17025《检测和校准实验室能力的通用要求》ISO/IEC17020《各类检查机构能力的通用要求》ISO/IEC指南43《标准物质生产者能力的通用要求》ISO15189《医学实验室—质量和能力的具体要求》ISO15190《医学实验室—安全要求》ISO15195《医学参考测量实验室的要求》ILAC、APLAC的相关要求目前三页\总数六十页\编于十四点认可及认证

认可：

正式表明合格评定机构具备实施特定合格评定工作的能力的第三方证明。

认证：

定义：由认证机构证明产品、服务、管理认证只能向客户保证某组织处于有效的质量或环境、安全管理体系，认证不适合实验室或检查机构。目前四页\总数六十页\编于十四点问题：作为供应商我们如何提供ISO15189认可实验室更好的服务？

文件提供：

仪器校准及性能验证报告、仪器校准SOP文件、仪器SOP文件、试剂SOP文件、试剂项目溯源性及不确定度文件、仪器操作卡、仪器保养卡

服务提供：提供技术支持咨询服务目前五页\总数六十页\编于十四点

ISO15189医学实验室--质量和能力专用要求提出：目前六页\总数六十页\编于十四点因此，按照ISO1519要求需要对仪器进行检定或校准，对性能参数进行评价或验证。实验室设备5.3.4中提出的仪器每年校准和/或验证要求，贝克曼库尔特公司一直在认真执行，如瑞金医院、曙光医院、同济医院等，工程师或技术支持人员都给予每年一次或两次的仪器校准。

目前七页\总数六十页\编于十四点

检验程序中5.5.3C中提到性能参数：如线性、精密度、以测量不确定度表示的准确性、检出限、测量区间、测量真实性、分析灵敏度和分析特异性。医院检验科室会按照不同的仪器来执行性能参数的验证。同样，我们也会提供仪器校准后的一份性能验证报告。目前八页\总数六十页\编于十四点

那么，不同仪器的校准和性能验证的方案也不尽相同，但大的方向是一致的，即“ISO15189的5.5.2中明确要求：实验室应只用确认过的程序证实所用检验程序适合其预期用途，证实应尽量充分以满足给定用途或满足某领域应用的需求。实验室应记录证实所得的结果及使用的程序。应评估所选用方法和程序，在用于医学检验之前应证实其可给出满意结果。实验室负责人或指定的人员应在开始即对程序评审并定期评审。评审通常每年一次。评审应文件化。”目前九页\总数六十页\编于十四点按照《CNAS-GL21：2008医学实验室质量和能力认可准则在临床生物化学检验领域的指南》要求：

目前十页\总数六十页\编于十四点配套分析系统非配套分析系统系统性质已获认可的检测系统用户自建的检测系统溯源性有溯源性没有溯源性用户需通过下述方法证明其自建系统的每个项目与“配套系统”具有可比性至少40例新鲜血样，均匀分布于医学决定水平范围内，与“配套系统”比对，每天用两种方法测定，至少测定5天（EP9-A2）性能参数证实/验证和评价用户对厂家提供性能参数通过实验进行证实/验证：精密度、正确度、可报告范围、参考区间用户对系统做性能参数评价：精密度、正确度、可报告范围、参考区间、灵敏度、特异性性能参数验证/评价方案举例精密度样品：2个浓度水平，最好使用与厂家评价时浓度相似的样品实验天数：5天以上实验次数：每批每个水平作4次重复检测(EP15)精密度样品：基质与临床样品相似，2个以上浓度（参考医学决定水平）实验天数：20天以上实验次数：每天2批，每批2个样品，每个样品重复2次（EP5-A2）目前十一页\总数六十页\编于十四点生化仪器校准报告模板按照《YYT0654-2008全自动生化分析仪》行业标准进行仪器硬件校准，并出具校准合格报告。目前十二页\总数六十页\编于十四点免疫仪器校准报告模板目前十三页\总数六十页\编于十四点目前十四页\总数六十页\编于十四点特定蛋白仪器校准报告模板目前十五页\总数六十页\编于十四点目前十六页\总数六十页\编于十四点检测系统的性能验证内容精密度正确度分析测量范围（线性范围）可报告范围参考区间灵敏度特异性目前十七页\总数六十页\编于十四点检测系统分析性能验证一、精密度性能验证

概念：指规定条件下所获得的独立测量结果的接近程度，通过不精密度反映。常用标准差或变异系数来表示。可分为批内精密度、批间精密度、日间精密度、室内精密度（总精密度）。目前十八页\总数六十页\编于十四点EP5-A2目前十九页\总数六十页\编于十四点

实验方法①：

（《EP5-A2

定量测定方法的精密度性能评价》）整个评价过程应使用同一批号的试剂和校准品。选用稳定的、血清基质的质控品。

推荐使用2个浓度，尽可能选择与厂商声明性能相近的浓度或接近“医学决定水平”浓度。2×2×20方案：每天检测2批，每批间隔1小时，每批检测2次，共进行20天，获得80个有效数据

通过计算可获得：批内、批间、天间、以及总不精密度

判断：进行离群值检验后，计算批内精密度和室内精密度与厂商提供的性能参数比较，小于95%区间上限界值可接受。目前二十页\总数六十页\编于十四点EP15-A2目前二十一页\总数六十页\编于十四点实验方法②（

《EP15-A2用户对精密度和准确度性能的核实》）

样本应模拟病人标本基质（质控品、校准品、已分析过的病人标本及厂家用于精密度试验的物质都可使用），尽可能选择接近“医学决定水平”的浓度或与厂商提供的浓度相近，也可选择可报告范围内的上限或下限附近的浓度。每天分析1个批次，2个浓度，每个浓度重复测定4次，连续5天计算获得：批内精密度、总精密度判断：与厂家声明比较，如大于厂家声明，则计算验证值，并与验证值比较，≤验证值则核实了厂家声明，否则需要查找原因。目前二十二页\总数六十页\编于十四点二、正确度性能验证

概念：

正确度（trueness）：完整的表述为测量正确度，是大批检测结果的均值与真值的一致程度。用“偏倚（bias）”表示。准确度（accuracy）：完整的表述为测量准确度，是检测结果与被测量真值之间的一致程度。用“偏离（deviation）”表示。目前二十三页\总数六十页\编于十四点EP15-A2目前二十四页\总数六十页\编于十四点EP9-A2目前二十五页\总数六十页\编于十四点目前二十六页\总数六十页\编于十四点实验方法1：方法学比对（CLSIEP9-A2《用患者样本进行方法学比对及偏倚评估）实验方案：选取至少40份临床病人样本，其浓度应尽可能均匀分布于分析测量范围内。分别用实验方法和比较方法（可以是参考方法，或厂家声明的方法或者用户目前使用的常规方法，且其准确度已经得到确认）检测，每天检测8个样本，每个样本重复测定2次，重复测定时样本的顺序应颠倒，共进行5天。统计判断：进行离群值检验和偏倚恒定评估，对x值合适范围进行检验，通过线性回归计算预期偏倚，并与允许偏倚比较，判断是否可以接受。接受标准：1/2CLIA’88允许总误差（TAE），或者以生物学变异导出的分析质量目标

目前二十七页\总数六十页\编于十四点

实验方法2：方法学比对（CLSIEP15-A《用户对精密度和准确度性能的核实实验－批准指南》）

实验方案：收集20份病人样本，其浓度应分布整个线性范围，不要使用超过线性范围的样本；分别用实验方法和比较方法检测，可1天内全部测完，也可持续3－4天，每天测定5－7个样本。

统计判断：计算偏倚或百分比偏倚，如小于厂家声明，则核实了厂家声明。目前二十八页\总数六十页\编于十四点实验方法3：对定值参考物质检测实验方案：通过检测定值的参考物质计算其回收率或者偏差来验证。定值参考物来源：a、用参考方法或决定方法定值的新鲜冰冻人血清，可从美国国家标准局（NIST）和CAP获得

b、从能力比对试验（proficiencytest，PT）中获得的参考物，如CAP或卫生部临检中心提供的室间质量评价控制品？

c、厂家提供的正确度确认物或质控品，也可用不同批号的校准品目前二十九页\总数六十页\编于十四点三、分析测量范围性能验证分析测量范围（analyticalmeasurementrange，AMR）：

指患者样本未经任何处理（稀释、浓缩或其它预处理），由检测系统直接测量得到的可靠结果范围，在此范围内一系列不同样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比例关系。AMR的评价有助于发现方法学原理、仪器、校准品、试剂、操作程序、质量控制计划等很多方面的误差来源。

临床可报告范围（clinicalreportablerange，CRR）：

指定量检测项目向临床能报告的检测范围，患者样本可经稀释、浓缩或其它预处理。对于CRR大于AMR的检验项目，需进行最大稀释度验证试验，并结合临床决定水平和功能灵敏度来共同确定该项目的CRR。目前三十页\总数六十页\编于十四点实验方法：

a.平均斜率法

采用最小二乘法直线回归作统计分析方法。直线回归方程：Y=b0+b1X，b0：为Y轴截距，代表恒定系统误差，应尽可能接近0b1：为斜率，代表比例系统误差，多有仪器校准时样本的加样量误差所引起最好有5个或以上的系列浓度的样本，浓度范围遍布整个预期检测范围，各实验样本内含分析物浓度可以呈等间距比例关系。

收集分析测量范围的低限（L）和高限（H）浓度水平分析物的病人样本，按六个浓度操作为例：1L，0.8L+0.2H,0.6L+0.4H,0.4L+0.6H,0.2L+0.8H,1H。目前三十一页\总数六十页\编于十四点b.用线性验证品验证：线性验证品来源：厂商、美国病理学家协会（CAP）、卫生部临床检验中心分析物的浓度或活性涵盖分析物的可报告范围，6份样本，每份样本测定2次，并计算平均值。（卫生部临床检验中心规定分析物的浓度或活性应涵盖分析物的可报告范围，共5份样本，每份样本测定4次，并计算平均值）线性1：采用多项式回归分析判断多项式拟合数据时线性还是非线性，当最适多项式为线性拟合模型时，直接判断为线性。线性2：当非线性多项式拟合数据点比线性好时，先看最适多项式与线性拟合之间的平均线性偏差（ADL）,如果ADL小于方法学允许线性偏差时，可当线性对待。目前三十二页\总数六十页\编于十四点EP6-A目前三十三页\总数六十页\编于十四点c.EP6-A实验方法：

EP6-A采用了二元一次直线回归、二次与三次的曲线回归统计处理，以统计估计值与实际检测值的差异（统计误差）来判断，统计误差最小的，为最适直线或曲线。而且在分析过程中和临床应用紧密结合，设定临床允许偏差。当线性评价的结果从统计上认为非线性，但是若采用线性方式处理病人结果，引入的误差不超过临床允许误差，可以接受作为线性处理，称为临床可接受线性。选择合适的高、低浓度水平混合血清，按比例配制成系列浓度的样本。核实测量范围：5到7个样本，每个样本重复测2次；改良方法：7到9个样本，每个样本重复测2到3次；建立测量范围：9到11个样本，每个样本重复测2到4次。目前三十四页\总数六十页\编于十四点目前三十五页\总数六十页\编于十四点临床可报告范围：可报告范围=定量检测限+分析测量范围（线性范围）+最大稀释倍数目前三十六页\总数六十页\编于十四点最大稀释度实验：实验室可以从日常检测的样品中选择一到三个浓度较高的样品（接近线性范围上限）。用厂商提供的稀释液（即日常检测用的稀释液）按照厂商提供的可稀释倍数来稀释。然后检测稀释后的样品浓度，将检测值与预计值比较，以美国CLIA'88能力验证计划的分析质量要求为标准判定结果是否可接受，如果在可接受范围内，证明验证了该稀释倍数是可靠的。目前三十七页\总数六十页\编于十四点四、分析灵敏度性能验证空白限（limitofblank，LoB）：在规定的可能性条件下，空白样品被观察到的最大检测结果。检出限（limitofdetection，LoD）：样本中分析物的最小量，可以在规定的可能性条件下予以检出，但可能还不能量化为一个确切的值。定量检出限（limitofquantitation，LoQ）：在规定的可接受精密度和正确度条件下（总误差符合准确度要求，临床应用可接受），能定量测出样本中分析物的最小量。相互关系：LoB<LoD≤LoQ目前三十八页\总数六十页\编于十四点α=假阳性可能β=假阴性可能总误差<检验目标相对频率0LoBLoDLoQ总误差报告αβ不能检出能检出能检出可检测<LoB<LoD<LoQ目前三十九页\总数六十页\编于十四点

LoB验证方案：

依据NCCLSEP17-A《检出限和定量检出限确定方案－批准指南》：①准备四份浓度等于或接近声明的LoD的样本，用参考方法检测以确认是否在LoD附近②用测试方法，检测上述样本，每个样本重复测定5次，获得20个结果③计数超过厂家声明空白限（LoB）的检测结果数，如果计数结果≤3个，则验证了厂家声明注：样本可以用MastercheckLevel1或者校准点B或其它材料进行稀释获得目前四十页\总数六十页\编于十四点LoD验证方案：

依据NCCLSEP17-A《检出限和定量检出限确定方案－批准指南》：①准备四份浓度等于或接近声明的LoD的样本，用参考方法检测以确认是否在LoD附近②用测试方法，检测上述样本，每个样本重复测定5次，获得20个结果③计数超过厂家声明空白限（LoB）的检测结果数，如果计数结果≤3个，则验证了厂家声明目前四十一页\总数六十页\编于十四点LoQ验证方案：

依据NCCLSEP17-A《检出限和定量检出限确定方案－批准指南》： 准备一份浓度等于或者接近LoQ的样本，用参考方法或已经确认的方法检测该样本，记录靶值 ①用测试方法测定上述浓度接近LoQ的样本，一个批次，重复检测25次，记录检测结果 ②确定可允许总误差（TEA）：总误差＝不精密度×2＋偏倚（注：1、偏倚可以从干扰测定中获得，如10％；2、不精密度和干扰可以从试剂说明书中关于性能说明的章节中获得） ③计算允许范围：允许范围=A-(B×A)到A+(B×A)（A：样本的靶值；B：可允许总误差） ④该25个结果，其中≤3个结果落在可允许范围外，即验证了厂家声明的LoQ

目前四十二页\总数六十页\编于十四点检测低限（lowerlimitofdetection,LLD)：样本单次检测可以达到的非空白检测响应量对应的分析物量。生物检测限（biologiclimitofdetection,BLD）：某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析物浓度或其它量值为生物检测低限。目前四十三页\总数六十页\编于十四点分析灵敏度（analyticalsensitivity）：检测系统或方法可检测的最低分析物浓度称为分析灵敏度或称为检测限。功能灵敏度（functionalsensitivity）：

以日间重复CV为20％时，对应检测限样品具有的平均浓度，是检测系统或方法可定量报告分析物的最低浓度或其它量值的限值。目前四十四页\总数六十页\编于十四点功能灵敏度验证方法1（定性项目）：①找一份阳性样本（中值或者高值），用已知阴性样本作为稀释液，进行系列稀释：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32（直到稀释的样本检测结果呈现阴性）②分别用参考方法和实验方法检测上述稀释前和稀释后的样本，每个样本重复检测2次；计算每个样本检测结果的均值，并判断阴性或者阳性；③判断：如果实验方法和参考方法具有可比较的灵敏度，则实验方法呈现阳性的最大稀释因子应该等于或大于参考方法呈现阳性的最大稀释因子。本方法用于确认定性实验的灵敏度。目前四十五页\总数六十页\编于十四点方法2（定量项目）：①准备一份浓度处于或低于试剂说明书宣称的功能灵敏度的样本②样本连续测定5天，每天重复测定4次，获得20个测定数据③计算每个样本的均值、SD和%CV④如果计算的CV≤20％，则验证了厂家的声明目前四十六页\总数六十页\编于十四点五、生物参考区间验证C28-A2:建立目前四十七页\总数六十页\编于十四点建立参考区间（《C28-A2临床实验室如何定义和测定参考区间》）建议至少120个参考值数据，参考个体不要集中于青年人，对儿童和老年人也应分别予以考虑。参考值数据是否需要分组，主要根据临床意义，并作Z检验，确定分组后的均值间差异有无统计学意义。按分组要求将原120个参考值数据分成2组或2组以上。最常见的是份年龄组和性别组。目前四十八页\总数六十页\编于十四点C28-A2：转移目前四十九页\总数六十页\编于十四点转移：《EP-09-A2用患者样本进行方法比对以及偏倚评价》目前五十页\总数六十页\编于十四点2、C28-A2转移参考区间（《EP-09-A2用患者样本进行方法比对以及偏倚评价》）

依赖其它实验室或厂家提供的参考值数据。要把这些参考值数据转移到用户实验室必须满足某些必要条件方可接受。这些条件因不同的情况而定，主要包括以下内容：

a.使用相同分析系统（包括方法和仪器）参考区间的转移b.使用不同分析系统（不同的方法和仪器）参考区间的