DNA多态性及其分析3

DNA多态性及其分析演示文稿目前一页\总数四十九页\编于十二点DNA多态性及其分析目前二页\总数四十九页\编于十二点第一节多态性概述

一．定义自然界的生物有千百万种，每一种生物的个体之间存在着许多的差异。一种生物群体内，某一性状方面也存在着不同的个体变异。不同种的生物以及同一种生物的不同个体之间都存在着许多差异，称为生物的多态现象，即生物的多态性。（polymorphism）目前三页\总数四十九页\编于十二点环境因素遗传因素营养、气候、疾病等遗传多态性生物进化遗传多态性（geneticpolymorphism）不同个体之间，其生化特征、抗原特性都存在着由遗传造成的变异，形成一系列的多态性，由相应的基因控制。

目前四页\总数四十九页\编于十二点二．标准

基因座位：基因在染色体上的位置等位基因（alleles)：二倍体个体中，位于一对同源染色体相等位置上（相同座位上），控制着同一性状的基因，具有两种或两种以上的形式。纯合子：二倍体中，在一定的座位上带有两个相同的等位基因的个体。杂合子：在一定的座位上带有两个不同的等位基因的个体。（一般是针对所研究的一对或几对基因而言。）目前五页\总数四十九页\编于十二点多态性：发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。

个人——一对等位基因（如ε1/ε2

，或ε2/ε3）人群——复等位基因（如ε1

、ε2

、ε3、

ε4）,如

ABO血型基因、人类白细胞抗原基因二态性（dimorphism）：在某些时候，一个基因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况，被称为二态性。

目前六页\总数四十九页\编于十二点遗传多态性广泛存在于生物界。果蝇有着大量的蛋白质水平上的遗传变异哺乳动物的免疫球蛋白有高度的遗传多态性即使是纯系的小鼠，其免疫球蛋白IgG2a重链编码区1108个碱基中就有110个（10%）的碱基组成互不相同，其中有18个碱基替换是同义的，其余的变异则编码不同的氨基酸。

目前七页\总数四十九页\编于十二点三．分类

遗传表型的多态性

DNA的多态性

由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型

红细胞表面的抗原多态性系统：有ABO、Rh等20余种

人类白细胞抗原（HLA）系统

人类的免疫球蛋白

性状：生物体表现出的形态特征（如花色）和生理生化特征（如抗病性、合成某种物质的能力)。表型：个体所具有的全部或部分性状。是基因型与环境作用的结果。目前八页\总数四十九页\编于十二点人30亿碱基（bp)基因及相关序列20%~30%

编码序列＜10%——检测表型多态性非基因序列70~80%中度或高度重复序列20-30%单一或低拷贝序列70-80%在所有生物体的基因组中都存在着天然的DNA序列变异由于基因组的大多数序列不编码蛋白质，因此可容纳大量的序列变异估计在人群个体之间每200~400个核苷酸就能检测到一个核苷酸的变异。某一变异的群体频率达到或超过1%即被认为属DNA多态性。目前九页\总数四十九页\编于十二点遗传表型的多态性只反映出编码基因的部分变异DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变基因的表达也会有变异：

——环境作用

——从基因到基因产物会受到许多因素的影响，而改变最终产物。分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示生物的多态性目前十页\总数四十九页\编于十二点第二节DNA多态性的分类一．基因多态性

二．重复序列多态性

三．性染色体多态性

四．线粒体的DNA多态性

目前十一页\总数四十九页\编于十二点一．基因多态性

基因的多态性遗传表型的多态性

在生物群体中，对于某一基因座位来说，属于这一位点的等位基因越多，这一座位的基因多态性就越复杂。

HLA白细胞抗原系统：仅HLA-DR抗原的编码位点就有HLA-DRA，-DRB1，B2，B3，B4，B5等10个座位，超过200个等位基因。目前十二页\总数四十九页\编于十二点二．重复序列多态性

串联重复序列

——相同的核心序列（coresequence）按首尾相接的方式排列。在重复序列两翼，DNA片段的碱基组成相同限制性内切酶不同长度的DNA片段GATCGATCGATCGATC12BAssDNA探针大片段小片段目前十三页\总数四十九页\编于十二点（1）不同个体——核心序列重复的次数不同（2）不同的串联重复序列，其核心序列的组成会不同（3）在核心序列之间，有时不同的个体间会存在有无插入小段的DNA序列或插入的片段长短不同之差DNA指纹由于不同的个体其核心序列重复的次数不同，应用限制性内切酶酶切时，形成不同长度的DNA片段，这类多态性被称为VNTR（variablenumbersoftandemrepeats，VNTR），可变数串联重复序列多态性。两个无关个体之间的VNTR的变异能达到完全个体特异的程度目前十四页\总数四十九页\编于十二点小卫星DNA（minisatelliteDNA）:串联重复序列中有一类较短的，称为～。许多基因的内含子部分含有此类序列。

特点：G＋C含量高插入或缺失此类序列的事件发生频繁，有时还会发生跳跃复制的现象。

1985年，Jeffreys等首先用人肌红蛋白基因内含子中一段高度重复的小卫星DNA为探针，获得了具有个体特异性的DNA指纹图谱。目前十五页\总数四十九页\编于十二点中度重复的散在重复序列：散在重复序列的某些重复单位可能是转座子（transposon）。

——一种能够反复插入到基因组中许多位点的特殊DNA片段。它可以从基因组上一个位点转移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个复制子。

目前十六页\总数四十九页\编于十二点三．性染色体多态性

X染色体——着丝粒周围也有一类重复序列形成X染色体的VNTR类多态性。Y染色体——在哺乳动物的染色体中Y染色体似乎是最少保守性的。用不同的限制性内切酶和DNA探针，可以揭示出Y染色体特异性片段的多态性。目前十七页\总数四十九页\编于十二点四．线粒体的DNA多态性

线粒体DNA属于核外基因，表现为非孟德尔规律遗传。人mtDNAD环一端347bp的序列分析资料证明，两个无关个体间，这一段mtDNA序列完全相同的可能性只有0.27%（即1/370）。因此，mtDNA序列组成的多态性同样可以用作个体识别。目前十八页\总数四十九页\编于十二点SNP单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

目前十九页\总数四十九页\编于十二点第三节

DNA多态性分析技术

1979年，Jeffreys等人首先用限制性内切酶和-珠蛋白基因探针直接观察到DNA的多态性。即限制性片段长度多态性技术。1985年，Mullis等发明了聚合酶链反应（polymerasechainreaction，简称PCR）技术，对DNA多态性的分析。目前二十页\总数四十九页\编于十二点一．RFLP分析技术

（一）基本原理

限制性酶切片段长度多态性技术，简称RFLP技术（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）目前二十一页\总数四十九页\编于十二点1.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。不同的限制性内切酶有各自特异的识别序列，一般为4~8个碱基对。2.DNA区段碱基组成不同。用一种限制性内切酶消化，就会产生不同长度的酶切片段。目前二十二页\总数四十九页\编于十二点A含1,2两个酶切位点的DNA片段B点突变使酶切位点1缺失C点突变产生酶切位点3D序列重排使酶切位点2移位E含有酶切位点2的片段缺失F序列插入，如存在数量不同的串联重复序列，即VNTR12122312112目前二十三页\总数四十九页\编于十二点采用合适的限制性内切酶切出一系列长度的DNA片段根据片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相同用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂交图谱反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。RFLP——通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同，因而称为限制性酶切片段长度多态性技术。目前二十四页\总数四十九页\编于十二点（二）RFLP技术的基本步骤抽提DNA（从血或组织）培养细菌人工合成探针

限制性内切酶消化质粒纯化纯化探针琼脂糖凝胶电泳标记探针（同位素或非同位素）Southern转移、固定

预杂交

杂交

洗膜

放射自显影或显色后分析结果RFLP技术的基本步骤靶DNA的准备

核酸探针的标记杂交显示目前二十五页\总数四十九页\编于十二点正常人染色体DNA含有4个完全一样的α-珠蛋白基因，而α-地中海贫血患者则缺失一个或数个α-珠蛋白基因用α-珠蛋白基因探针对患者或产妇进行RFLP分析：当用EcoRI和HpaI酶切后，正常人标本出现4.8、4.1kb两条杂交带；患者仅出现5.6kb杂交带用EcoRI和HindIII酶切后，正常出现2.1、3.1、16kb杂交带；患者出现2.1、16kb杂交带。遗传性疾病的基因诊断和产前诊断α-地中海贫血5.6kb4.8kb4.1kb16kb3.1kb2.1kb目前二十六页\总数四十九页\编于十二点（三）RFLP技术可选择的几个因素

1．限制性内切酶是影响RFLP图谱的一个重要因素。已分离500种，常见的100多种

①识别序列：多数为4至6个碱基识别4个碱基对的限制性内切酶能把人基因组DNA切出较短的小片段，而识别6个或更多碱基对的限制性内切酶，酶解出的较长的DNA片段。

如Sao3AI识别GATC如EcoRI位点为GAATTC

②反应条件：包括反应液的pH，内含乙醇、甘油的量，反应温度和时间等，以及DNA的质量和浓度。星号*活性，即非特异性酶解活性

目前二十七页\总数四十九页\编于十二点

限制性核酸内切酶——能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

识别位点：回文序列

反转重复序列，即旋转对称结构一般为4~8个碱基对例如EcoRI的识别序列：

5＇-GAATTC-3＇

3＇-CTTAAG-5’BamHI识别序列：5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’目前二十八页\总数四十九页\编于十二点2．核酸探针

由于人基因组DNA链很长，用某一限制性内切酶消化后，酶解出来的各种不同长度的片段往往数量巨大，电泳后几乎是连续排列的，无法进行分析比较。

选取某种特定的DNA片段作为探针，标上一定的标记物（如同位素、生物素等），利用碱基互补的两条DNA单链能结合（杂交）的原理，就可以在连续排列的一系列DNA片段中显示出与探针有同源序列的某些DNA片段。不同的DNA探针会显示出不同类型的RFLP图谱。

目前二十九页\总数四十九页\编于十二点探针分类：（1）基因探针大多数取自人基因组中某一基因的一个片段。人类基因组中，最早确定有多态性的是α珠蛋白基因位点和胰岛素基因位点。cDNA探针——用mRNA反转录成cDNA，探测的是此基因中的外显子部分。人工合成——可以随研究者的设计而合成

目前三十页\总数四十九页\编于十二点（2）随机探针

随意挑选出的DNA片段

要能够揭示出人基因组DNA的酶切片段长度多态性就行。特点：能比较快地了解该染色体的某些限制性片段多态性与研究对象（如某种疾病基因）的相关性。片段较大的随机DNA探针比片段较小的更易检测出RFLP来

目前三十一页\总数四十九页\编于十二点（3）重复序列探针

如α小卫星DNA，其重复单位群集在基因组的某一特定区域。重复序列探针能检测出基因组中多处具有此类重复序列的DNA片段。特点：能一次性检测出多个位点的DNA片段多态性

目前三十二页\总数四十九页\编于十二点Jeffreys等从第22号染色体上肌红蛋白基因的内含子中分离出来的高度可变的“小卫星DNA”探针。

并证明两个无关个体之间，这类多态性相同的机会极微（只有3×10－11），因而他称这种RFLP图谱为DNA“指纹”。应用：亲子鉴定法医学个人认定人类学研究遗传病相关性分析目前三十三页\总数四十九页\编于十二点人的DNA指纹分析示意图子女DNA指纹图中分别与其父、母的DNA指纹中相应的分子杂交条带相对应目前三十四页\总数四十九页\编于十二点（4）人工合成的寡核苷酸探针

1986年，Ali等以AluI和MboI酶消化人基因组DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷酸作探针进行检测，发现其RFLP图谱同样具有个体特异性。这类探针检测的对象主要是人基因组中的散在重复序列DNA。提示：根据自己研究的主要对象来设计各种各样的探针（包括各种长度的以及各种碱基组成的）。人基因组DNA用合适的探针和限制性内切酶酶切，一般都能揭示出人基因组中的RFLP。

目前三十五页\总数四十九页\编于十二点1.检测对象的DNA分子必须保持大分子。在抽提DNA过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则最终的结果可能是一种假象。2.在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则也会出假结果。3.被消化的DNA浓度不能太高。4.电泳时要低电压电泳。5.杂交前探针必须充分变性。6.要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和GC含量来掌握洗膜的条件。7.作放射自显影时，要根据探针标记的放射比活性以及靶DNA的量等因素决定曝光的时间。

注意目前三十六页\总数四十九页\编于十二点二．PCR分析DNA多态性

PCR（polymerasechainreaction）是一种在试管里扩增特定的DNA片段的技术。设计引物：按照所研究的DNA（称靶DNA）片段的特点，设计出与此DNA片段二翼的DNA序列互补的寡核苷酸。变性：通过加热（92~95℃）使靶DNA（又称DNA模板）变性成为两条单链DNA。退火（复性）：然后将温度降至37℃~55℃，引物就会结合在模板DNA中与其碱基互补的序列上。延伸：将温度升至70℃~72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，引物就会按5’→3’的方向，严格按照碱基互补的原则，逐步延伸。

目前三十七页\总数四十九页\编于十二点1．分析基因多态性

方法：特异性引物

扩增特异性基因片段与此位点上所有的等位基因探针都杂交确定属哪个等位基因

等位基因间的差异一般表现为几个碱基或十几个碱基组成的不同，因而区分这些不同的等位基因多采用等位基因特异性探针（allele-specificoligonucleotideprobe，ASO）与扩增出来的DNA片段进行杂交，根据能与哪一个探针进行杂交来确定该DNA片段属哪一个等位基因。人类HLA系统——已知有30多个位点，超过500个等位基因。其中的某一位点，往往有多个、甚至几十个等位基因。

难以实现多态性的分析目前三十八页\总数四十九页\编于十二点2．分析扩增DNA的限制性片段长度多态性

扩增DNA的限制性酶切片段长度多态性（Amplificationrestrictionfragmentlengthpolymorphism,简称Am-RFLP）技术

概括为：PCR+酶切应用举例：串联重复序列的核心很短（只有4～5bp），重复次数的差异又不大时，其扩增产物的长短较为接近，用普通琼脂糖凝胶电泳难以区分开来。这时可以根据扩增片段碱基组成的规律，选择某种限制性内切酶对扩增片段酶切。这种酶切片段的长度差异往往较大，可以用琼脂糖凝胶电泳区分出不同的等位基因。

目前三十九页\总数四十九页\编于十二点载脂蛋白E（apoE）基因多态性与心脑血管疾病和老年痴呆密切相关，确定个体apoE基因对临床应用研究及诊断治疗十分必要。ApoE三种常见的等位基因是ε2、ε3、ε4，对目的基因进行PCR扩增后，以CfoI内切酶消化，结果：一般在扩增的片段较长时常用此方法。较为简便，无需测序和杂交，适于大范围人口检测和临床实验室开展。也称为PCR-RFLP。目前四十页\总数四十九页\编于十二点3.随机引物PCR法分析DNA的多态性

随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)1990年，Willian和Weles等创建方法：由于DNA组成完全是个体特异的，随意设计单个很短的引物去扩增不同人的DNA模板结果：扩增出来的DNA片段的数量和大小会因人而异，通过电泳可以把不同个体的DNA扩增产物区分开来。目前四十一页\总数四十九页\编于十二点引物：长10个碱基左右，G和C的含量在50~80%之间，不含回文结构，而且单条引物即可。特点：可以在完全不知道特定DNA顺序的情况下分析其多态性，方法简便，能检出的遗传信息量大。目前四十二页\总数四十九页\编于十二点西红花及其伪冒品的RAPD指纹图1.Marker2.西班牙红花3.印度红花4.川红花5.莲须6.玉米须7.黄花菜不同来源同种药材的RAPD指纹图1.新鲜西洋参2.干品西洋参3.西洋参组织培养物4.新鲜人参5.生晒参1（干品）6.生晒参2（干品）

目前四十三页\总数四十九页\编于十二点应用：不仅可用于个人识别、疾病的相关性分析，还可用于其它各种遗传学研究（中药鉴定）。优点：①可以用一系列的通用引物分析不同种类的生物。②可用于制备探针和分析未知的DNA顺序。③由于每一个RAPD标记对应一种DNA顺序，可大大简化多种相关研究。（通过随意引物扩增的DNA顺序，称为RAPD标记）

目前四十四页\总数四十九页\编于十二点4.简单重复序列间区（inter-simplesequencerepeats,