罗氏实时荧光定量仪

定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度PCR循环=双链DNA=染料=荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBRGreenI取代EB目前一页\总数四十页\编于十九点荧光定量实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性全程监控，准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便，无需跑胶目前二页\总数四十页\编于十九点

罗氏产品介绍以及与同类产品之间的对比目前三页\总数四十页\编于十九点一、LC1.5和LC2.0LightCycler荧光定量PCR系统

LC1.5LC2.0目前四页\总数四十页\编于十九点Lightcycler1.5结构分析以空气加热及冷却迅速改变温度带有极高表面积/容量比例的密封20l毛细管加热线圈可容纳32个样品的卡盘将荧光仪定位的分档器发动机将样品置于光学仪上的分档器发动机热室风扇滤器免维护的LED光源光学倍增管目前五页\总数四十页\编于十九点Lightcycler2.0结构分析空气加热系统LED激发光源PMT检测系统光纤目前六页\总数四十页\编于十九点热力学结构特点：1、空气加热2、毛细管反应体系优点:1、升降温速度快（0.05℃-20℃/秒），2、体系均一，不存在边缘现象3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本实现快速PCR目前七页\总数四十页\编于十九点光学结构特点：1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上2、光学倍增管（Rodenstock）3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检测优点：1、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低，避免LED功率低的问题2、免维护，带自动检验功能3、轻易实现内标、内对照及多重PCR目前八页\总数四十页\编于十九点LightCycler

结构分析激发光源

Rodenstock-LED（发光二极管）

冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。

检测系统光学倍增管(PMT)灵敏度高，宽检验范围,背景低，无边缘效应

加热方式空气加热管间差小，热传导速率20℃/秒，温控变化准确（0.05-20℃/秒）。

反应体系

两种石英玻璃毛细管体系(20ul和100ul)

光学性好，反应体系小，节约试剂成本,适合多种用途。检测光路范围

530nm,555nm,610nm,640nm,670nm,710nm.六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题目前九页\总数四十页\编于十九点LightCycler软件4.0

更先进的自动定量方法全新的相对定量软件全自动熔点曲线分组全自动熔点温度提示简化数据和用户管理目前十页\总数四十页\编于十九点PCR领域最聪明的革新–LightCycler荧光定量PCR系统超高速

30至40分钟完成PCR过程实时在线监测收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上高灵敏在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝范围广可检测10－1010拷贝线性范围，无需稀释样品开放性全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台六个荧光通道轻易实现内标、内对照或多重PCR最小化

定量反应体积降至10－20ul，费用低廉灵活性

支持水解探针、杂交探针及

SYBRGreenI闭管分析

消除污染风险目前十一页\总数四十页\编于十九点Lightcycler的分析模式适用于所有的通用探针及染料分析模式：SYBRGreenI（荧光染料）TaqMan（水解探针）Molecularbeacon（分子信标）Lightcycler上开发独有的分析模式：HybridizationProbeFormat（杂交探针）SimpleProbe（单探针）目前十二页\总数四十页\编于十九点

SYBR-GreenI检测模式

SYBRGreenI能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中，SYBRGreenI可与新合成地双链DNA结合，产生地荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延期后进行。SYBRGreenI与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。目前十三页\总数四十页\编于十九点

水解探针（Taqman）检测模式

同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因Taq酶具有的5，－3，核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量有关。目前十四页\总数四十页\编于十九点

分子信标（MolecularBeaconProbe）独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5’端标记荧光分子，3’端标记一个吸收或淬灭荧光的分子。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5’端荧光分子与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。目前十五页\总数四十页\编于十九点杂交探针（HybProbe）检测模式

设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。目前十六页\总数四十页\编于十九点

AnnealingElongationEndofElongationDenaturationFluoresceinLCRedforsequencespecificdetectionofDNA杂交探针检测－罗氏专利性技术目前十七页\总数四十页\编于十九点Template:Plasmid;Target:CycA;DetectionFormat:HybridizationProbesStandardCalculated

concentration9.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O杂交探针的优点：1.灵敏度高2.宽动力学范围3.特异性高4.可用于突变分析MonitoringofPCRwiththeLightCycler

UsingHybridizationProbes目前十八页\总数四十页\编于十九点

专用于SNP基因分型和突变检测的SimpleProbeSimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有SNP位点的靶序列结合。探针与靶序列结合后，释放出能够被检测到的荧光信号，通过对熔点曲线分析中探针释放的荧光信号强度的分析，可以得到对目的基因的多态位点的准确分析结果。目前十九页\总数四十页\编于十九点Denaturationphase:SimpleProbefreeinsolution;emissionofreporterdyeisquenchedAnnealingphase:Fluorescencefromreporterdyeincreaseswhenprobeisannealedtoit‘scomplementarytarget5‘3‘-pQR3‘5‘primer5‘3‘-pQRNewProbeFormat:SimpleProbeFormat

-高效低成本的新型探针R=Reporter(Fluorescein)Q=Quencher目前二十页\总数四十页\编于十九点荧光定量PCR仪的部分应用医学相关研究

疾病的临床早期诊断病原体的含量检测合理用药分子水平的疗效研究疾病的发病监控研究肿瘤相关基因肿瘤、耐药基因的检测研究组织或培养细胞中mRNA的表达水平－各种处理对细胞mRNA含量变化的影响－比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究基因分型及SNP分析转基因动物及植物研究目前二十一页\总数四十页\编于十九点重点问题说明超高速的热循环——由于采用空气迅速改变温度，以及利用有高表面积/体积比的光学玻璃毛细管模式，使升降温速度最高可达20℃/秒，温控≤0.2℃，每20～30分钟便能完成30～40个循环。升降温数率唯一可调——可以根据实验的需要调整升降温速率的系统0.05~20℃/秒，优化实验。目前二十二页\总数四十页\编于十九点配套功能强大的分析软件：（1）绝对定量（具“单点定标”功能）（2）相对定量（可进行效率校正）（3）自动基因分型（SNP）（4）颜色干扰校正独特的熔点曲线分析功能，可进一步作PCR后分析：---检测非特异扩增并作矫正---鉴别基因型而又无需采用测序凝胶---检测点突变，并可利用双色检测及颜色补偿软件在同一反应中分析较复杂的突变目前二十三页\总数四十页\编于十九点

为什么使用DNase-Free&RNase-Free的光学玻璃毛细管?玻璃反应管可加快热传导速率.毛细管增加表面积/体积比，确保空气和反应成分之间的温度迅速平衡，温度均一.缩短了PCR反应时间，特别是荧光激发的时间，保证了反应成分的稳定性，尤其是荧光染料的稳定性。缩小反应体系，降低检测成本。光学玻璃毛细管的材料适合荧光讯号的测定，类似光纤的形状，保证荧光讯号的准确捕获。没有边缘效应.目前二十四页\总数四十页\编于十九点LightCycler/毛细管/试剂的成本核算仪器的维护费用LightCycler是免维护的仪器,采用的光源是普通的发光二极管，寿命长达20000小时以上，非常稳定，价格低廉。而卤素灯光源，寿命<2000小时，发光强度衰减明显，需要定期更换，价格昂贵。单一反应成本的计算单一反应成本包括试剂成本和反应管成本，由于毛细管的反应体系是10~20ul，而其他同类机器的反应体系是50ul，所以使用LC试剂的成本可以减少至少一半。目前二十五页\总数四十页\编于十九点LightCycler其他机型反应管价格0.45USD0.12USD反应体系10~20ul50ul反应液/试剂成本2.4USD4.8USD总反应成本2.85USD4.92USD目前二十六页\总数四十页\编于十九点LC1.5与同质产品的对比项目ROCHE

LightCycler1.5ABI

ABI7300

MJOPTICONI

备注

光源

LED（发光二极管）冷光源，免维修，开机可以马上进行操作，寿命>20000小时。卤素灯。寿命短，需预热，寿命2000小时。LED（发光二极管）,每一个孔位一个独立的激发光源和检测装置。LightCycler光源无需定期更换，稳定方便，光路相同，样本误差最小，节约成本。加热方式

空气加热，温控变化准确（±0.4℃）半导体加热制冷（温控±0.5℃）半导体加热制冷（温控±0.5℃）LightCycler变温速度快，温控精确。升降温速度热传导速率20℃/秒，（0.05-20℃/秒)热传导速率2.5℃/秒热传导速率2.5℃/秒LightCycler升降温速度快，并可调节运行时间

30－40分钟

2－3小时

1.5－2.5小时

LightCycler检测时间短，快速出结果，应用最灵活单点定标功能软件可支持单点定标功能无无LightCycler每次实验节约反应管和反应试剂4－5份，且单点拟合确保实验结果反应管反应体系(定量)石英玻璃毛细管10-20ul薄壁塑料管50ul－100ul专用薄壁塑料管50ul－100ul石英玻璃管荧光检测灵敏度好，导热快,试剂用量省目前二十七页\总数四十页\编于十九点项目ROCHE

LightCycler1.5ABI

ABI7300

MJOPTICONI

备注

光路波长及荧光接收模式530nm,640nm,710nm.并解决相关荧光素荧光干扰问题，光电杂合模式4通道，无颜色补偿功能,CCD镜头模式(需使用Rox染料进行校正,占用一个通道,实际只有3个通道可用)1通道，无颜色补偿功能,96个LED光源分别检测LightCycler检测波长经过优化，检测范围广泛，通道间相距较远，干扰最小，而且通过颜色补偿功能可将干扰降到最低程度检测方式

实时检测在线观测（每一循环光强度变化，温度变化，反应时间均可观测）实时检测在线观测实时检测在线观测LightCycler可实时检测整个PCR过程，也能在PCR运行中根据试验需要进行实验条件的调节,使用灵活.试剂定量方法Hybridizationprobes(杂交探针):(定量和熔点曲线分析，扩增范围100-1000bp）·TaqMan探针·SYBRGREENI·分子航标TaqMan探针（定量，解链曲线分析,扩增范围50-150bp〕SYBRGREENI·分子航标TaqMan探针（定量，解链曲线分析,扩增范围50-150bp〕SYBRGREENI·分子航标LightCycler使用的荧光检测模式最多，对于各种临床检测和科研实验，应用最为广泛动力学范围10X7X7XLightCycler检测线性范围广泛，无需特别处理样本目前二十八页\总数四十页\编于十九点LC2.0与同质产品的对比项目ROCHE

LightCycler2.0ABI

ABI7500

MJOPTICONⅡ备注

反应管反应体系(定量)石英玻璃毛细管10-100ul薄壁塑料管50ul－100ul专用薄壁塑料管50ul－100ul石英玻璃管荧光检测灵敏度好，导热快,试剂用量省光路波长及荧光接收模式六通道，530nm,560nm,610nm,640nm,670nm,710nm.并解决相关荧光素荧光干扰问题，光电杂合模式五通道，无颜色补偿功能,CCD镜头模式(使用的探针染料增加)2通道，无颜色补偿功能,96个LED光源分别检测LightCycler检测波长经过优化，检测范围广泛，通道间相距较远，干扰最小，而且通过颜色补偿功能可将干扰降到最低程度目前二十九页\总数四十页\编于十九点二、LC480LightCycler®480实时荧光定量PCR系统目前三十页\总数四十页\编于十九点高灵敏可检测单拷贝基因

动力学范围广可检测10－1010个拷贝

高重复性重复性高，CV＜0.3％

高分辨率轻松区分1000拷贝以下2倍浓度差异

高速40分钟完成40个PCR循环

技术创新采用Therma-BaseTM热循环专利技术和先进的光学检测系

统，彻底消除边缘效应，保持稳定优异的检测结果。

灵活分析模式多样，绝对定量，相对定量，融解曲线分析等几乎适用所有的检测模式（SYBRGreenⅠ，TaqmanProbe，Hybprobe，SimpleProbe等）

模块化可互换的96孔，384孔加热模块，用户可以自助更换模块，不需要工程师到场

自动化平台配以LIMS系统及自动进样机械臂，可实现远程操作及全

自动化运作

用户界面友好软件直观简洁，易操作

LightCycler®480系统主要特点目前三十一页\总数四十页\编于十九点LightCycler®480系统主要参数温度控制37℃－95℃最大升温速率4.8℃最大降温速率2.5℃激发光源标准氙灯检测装置冷CCD滤镜激发波长（nm）：450，483，523，558，615发射波长（nm）：500，533，568，610，640，670软件功能绝对定量、Tmcalling、含效率校正的相对定量、基因分型、产物鉴定等。目前三十二页\总数四十页\编于十九点创新的PCR热循环模块设计Therma-BaseTM是一个内壁布满灯芯状毛细管结构的腔体，通过一系列的冷凝合蒸发，Therma-BaseTM高效地传递热量，从而实现整板最大的温度均一性。Therma-BaseTM核心优势优异的空间温度均一性快速、准确的温度调控40个循环＜40分钟(384孔板)目前三十三页\总数四十页\编于十九点目前三十四页\总数四十页\编于十九点先进独特的光学系统

LC480系统使用宽光谱、高强度的氙灯作为光源。激发光经过多次反射后形成与孔板大小相同、光强均一的光柱，有效消除边缘效应。激发波长和发射波长的任意组合，使得多种荧光染料和检测模式可用于目前所有的实时荧光定量PCR实验。LC480光学系统的核心优势：

－最灵活地选择荧光染料及检测模式

－整板数据的精确捕获

－强大的多重PCR能力目前三十五页\总数四十页\编于十九点

多检测通道支持所有的检测模式

LightCycler®480系统