上海市临检中心 临床微生物检验学习班课件 厌氧菌检验新进展-赵虎

厌氧菌感染与诊断厌氧菌感染与诊断新进展复旦大学附属华东医院赵

虎2015-6-14厌氧菌感染与诊断一、厌氧菌感染厌氧菌感染率厌氧菌感染与诊断厌氧菌的感染率很高，约占总感染率的60％以上。菌血症或败血症:20%-30%，肺部厌氧菌:41.1%-84.2%，牙周炎和牙根管炎:96.67%-100％。其中一部分感染为单纯厌氧菌感染，但大部分感染是与需氧菌或兼性厌氧菌混合感染（82.23%）。厌氧菌感染类型厌氧菌感染与诊断厌氧菌感染可累及机体各个部位和组织，尤以口腔、肠道和女性生殖道等寄生部位及其邻近组织容易感染。厌氧菌感染临床表现厌氧菌感染与诊断厌氧菌感染的一般症状厌氧菌感染的特征临床表现—一般症状厌氧菌感染与诊断细菌感染的一般症状全身症状：

发热（低热）局部症状：

红、肿、热、痛实验室检查：白细胞总数和中性粒细胞数升高临床表现—特征厌氧菌感染与诊断

厌氧菌感染的特征

感染局部有气体产生

分泌物有恶臭、带血或呈黑色

发生在粘膜表面的感染

长期应用抗生素继发的感染

细菌学特征:

常规培养阴性，但直接涂片有细菌，且细菌染色不均、形态各异、明显的多形性厌氧菌感染与诊断二、厌氧菌培养与鉴定厌氧菌感染与诊断（一）厌氧菌样本采集与运送样本采集厌氧菌感染与诊断采集原则：体表及其与外界相通的腔道，即有正常菌群寄生的部位的标本，不宜作厌氧菌检查。采集方法：针筒穿刺抽取，严格无菌操作，尽量避免接触空气。样本选择厌氧菌感染与诊断

感染局部有气体产生

排出物有恶臭、带血、呈黑色或黄绿色

与肿瘤有关的感染

病程呈亚急性或慢性

长期使用氨基糖苷类抗生素无效者

发生在肛周、口腔、鼻窦、咽颊等部位感染

应用甲硝唑、替硝唑治疗有效者样本运送厌氧菌感染与诊断床边（直接）接种针筒运送法无菌小瓶运送法组织块运送法厌氧菌感染与诊断（二）厌氧菌的分离培养厌氧环境的建立厌氧菌感染与诊断机械换气法即抽气换气法，是最直接的去除容器内氧气的方法。用真空泵（空气压缩机）抽出容器内的空气，充以氮气、氦气等。因容器内的空气很难被完全抽尽（不可能达到真空状态），可通过多次抽气换气过程来达到厌氧状态。该方法操作较繁琐，临床上很少单独应用。厌氧环境的建立厌氧菌感染与诊断

化学吸收法

连二亚硫酸钠法（次二硫酸钠、保险粉）Na

S

O

+2NaHCO

+O

2CO

+Na

SO

+H

O2

2

4

黄磷燃烧法3

222

4

24P+5O

2P

O

,

P

O

+3H

O

2H

PO22

52

523

4

钢末法钢丝绒或钢末浸入硫酸铜溶液中，置换出的金属铜极易吸收氧气，形成氧化铜。

加氢除氧法2H

＋O

2H

O222厌氧环境的建立厌氧菌感染与诊断联合除氧法上述各种方法各有优缺点，而且一种方法很难达到很好的厌氧效果，临床上常采用二、三种除氧方法联合应用，如抽气换气法结合加氢和钯粒方法、抽气换气法结合连二亚硫酸钠法等，可达到较好的厌氧效果。常用的厌氧菌培养方法厌氧菌感染与诊断简易厌氧袋培养法用一种透明、不透气的塑料袋作为厌氧容器，内置化学吸氧装置、厌氧指示剂。放入接种好的平板后，立即启动化学吸氧装置，并迅速密封袋口，置35℃环境中培养。本法经济、操作简单，但容量较小。适用于少量标本的床边接种。简易厌氧袋厌氧菌感染与诊断培养方法厌氧菌感染与诊断

厌氧罐（盒）培养法透明、不透气的玻璃罐或塑料盒作为厌氧容器，内置化学产气装置和厌氧指示剂。部分玻璃制的厌氧罐（盒）有进、排气阀门，可通过抽气换气法先除去容器内大部分氧气，再用化学方法吸收剩余的氧气，可以更快、更好地达到厌氧状态。本法操作简单，容量较厌氧袋大，但使用的试剂较多，接种单个标本时不经济。厌氧罐厌氧菌感染与诊断培养方法厌氧菌感染与诊断

厌氧手套箱培养法由手套操作箱、传递箱、空气压缩机和控制版面、气体瓶等组成。手套操作箱正面为透明的有机玻璃，上有一副不透气的橡皮手套，可通过手套直接在操作箱内进行接种、鉴定的操作。内有恒温室，可直接培养厌氧菌。通过传递箱放入或取出物品。操作箱内长期保持厌氧状态，厌氧标本可迅速处于厌氧环境，有利于厌氧菌的分离培养。厌氧手套箱厌氧菌感染与诊断培养方法厌氧菌感染与诊断

多功能（厌氧微需氧）微生物培养系统（Multi-purposeIncubator）应用气体抽排置换原理，内置精密无油真空泵、高精度压力传感装置和软件控制处理系统，可自动控制气体的抽排与置换，使连接的罐体快速达到厌氧或微需氧环境。多功能微生物培养系统厌氧菌感染与诊断样本处理厌氧菌感染与诊断接种前样本的处理

检查标本来源是否符合厌氧菌培养的要求；

检查标本运送是否符合要求；

核实标本采集时间；

观察标本的性状

有无恶臭、血液、黑色、气泡、硫磺颗粒等；

革兰染色镜检。染色镜检厌氧菌感染与诊断

厌氧菌标本染色镜检，重要、必要。

提示有无细菌感染和有无厌氧菌感染。若镜下有细菌存在，而普通细菌培养无细菌生长，则提示有厌氧菌感染的可能。

大致判断标本中的细菌含量。

根据细菌的形态、染色性和排列方式，以及有无多形性、有无各种厌氧菌的特殊形态，为鉴定厌氧菌提供参考与依据。

芽胞、荚膜等特殊结构，为鉴定革兰阳性芽胞杆菌提供参考。初代培养厌氧菌感染与诊断培养基的选择厌氧血琼脂平板（郑州贝瑞特生物技术有限公司）胆汁七叶苷琼脂平板（BBE）卡那万古冻溶血琼脂平板（KVLB）TSN琼脂平板（新霉素和多粘菌素）CCFA琼脂平板初代培养厌氧菌感染与诊断标本接种每份标本接种2块普通血琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板，加1块厌氧选择培养基。2块普通血琼脂平板分别置有氧和CO2环境培养；厌氧血琼脂平板和厌氧选择培养基置厌氧环境培养。厌氧菌感染与诊断（三）耐氧试验耐氧试验厌氧菌感染与诊断从厌氧琼脂平板上挑取可疑菌落，分别转种2块普通血琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板，然后分别置有氧、CO2和厌氧环境中孵育。在有氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌；在有氧和厌氧环境中均不生长，仅在CO

环境中生长者为需CO

菌（苛养22菌）；而在有氧和CO2环境中均不生长，仅在厌氧环境中生长者，为专性厌氧菌。耐氧试验厌氧菌感染与诊断耐氧试验示意图厌氧菌感染与诊断（四）厌氧菌的鉴定一级鉴定（初步鉴定）厌氧菌感染与诊断从标本来源估计:来自有厌氧菌寄生的粘膜或皮肤附近的临床标本。从标本性状分析:有恶臭、气泡、血性、黑色或硫磺颗粒等。二级鉴定厌氧菌感染与诊断涂片染色镜检观察革兰染色性、形态、多形性、芽胞、荚膜、空泡和颗粒。抗生素纸片鉴定法观察新疆对卡那霉素、万古霉素、多粘菌素E，以及青霉素G、红霉素和利福平等的敏感性。生化反应三级鉴定厌氧菌感染与诊断在一、二级鉴定的基础上，补充各种单糖分解试验、七叶苷和明胶水解试验、葡萄糖苷酶等酶类试验，以及PYG脂肪酸气液相色谱分析等

最终确定待检厌氧菌的种与亚种。商品化的鉴定试剂厌氧菌感染与诊断API20A

（法国生物梅里埃公司）VITEK-ANI（法国生物梅里埃公）MICRO-01D（美国德灵公司）厌氧菌分离鉴定流程厌氧菌感染与诊断临床标本分离培养肉眼观察增菌培养耐氧试验染色、镜检专性厌氧菌药敏试验菌株保存分类鉴定形态染色

菌落特征

生化反应

药敏鉴定

气液相色谱鉴定及药敏结果厌氧菌感染与诊断三、厌氧菌其他检测方法厌氧菌感染与诊断（一）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（

MALDI-TOFMS

）MALDI-TOFMS厌氧菌感染与诊断基质辅助激光解析离子化/飞行时间质谱技术（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometer，MALDI-TOF-MS），首先将待测样本与基质混合，均匀涂布在样品板上，放入MS仪器。基质吸收来自激光的能量，与样本一起蒸发，与此同时将样本电离。带电样本通过电场进入飞行时间检测器，离子依质荷比不同而分离，最终可以在飞行管的末端检测到每个离子的丰度

从而进行细菌的快速鉴定。质谱技术厌氧菌感染与诊断布鲁克道尔顿公司和日本岛津公司质谱检测系统直接检测来自完整细菌的蛋白质构，用于微生物样品鉴定与分类。MALDI鉴别与分类微生物——

操作简单快速厌氧菌感染与诊断•

线性正电模式6004002000•基质:α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)•

测定质量范围:2000-20000

Da•每个样品测定时间仅需15秒;1.5h可测384个样品2000400060008000100001200014000160001800020000m/zMALDI鉴别与分类微生物——基于稳定表达的高峰度蛋白，结果可信度高厌氧菌感染与诊断ribosomal

Protein

m/z50004000300020001000RL36RS32RL34RL33meth.RL32RL30RL35RL29RL31RS214364,335095,825380,396255,396315,196410,607157,747273,457871,068368,760400045005000550060006500700075008000m/z厌氧菌感染与诊断质谱技术用途：MALDI-TOF-MS可检测细菌蛋白的表达，并可根据蛋白质表达对细菌进行快速鉴定。优点：重复性好，成本低，鉴定快速稳定，可与基因测序法媲美。缺点：需要专业知识和专用的仪器设备。厌氧菌感染与诊断质谱在微生物检验中的应用难培养或生长缓慢的微生物难鉴定的微生物无菌体液标本的直接检测

血培养

脑脊液

肺泡灌洗液耐药性检测质谱的应用——厌氧菌鉴定厌氧菌感染与诊断厌氧48h培养：革兰阴性，大小不等，两端纤细，呈梭杆状，排列无规则，疑似梭杆菌或拟杆菌。质谱和测序证实：坏死梭杆菌。质谱的应用——厌氧菌鉴定厌氧菌感染与诊断厌氧48h培养生长不良：涂片可见革兰阳性杆菌，弯曲，一端略尖，一端圆钝。排列呈八字或海鸥型，无芽孢及荚膜，疑似痤疮丙酸杆菌；质谱和测序均证实痤疮丙酸杆菌；改进厌氧装置显著提高阳性率。血培养报警直接鉴定厌氧菌感染与诊断4x105748.7162.01.51.00.50.03443.7354265.058.20004000600080001000012000140001600018000z肺泡灌洗液直接鉴定厌氧菌感染与诊断5x102067.9151.55274.106.0.50.020004000600080001000012000140001600018000m

/zβ-lactamase表达分析试验厌氧菌感染与诊断检测ESBLs菌株厌氧菌感染与诊断CTX水解脱羧为370.0m/zCTX水解为414.0m/z头孢噻肟药物+H头孢噻肟+克拉维酸厌氧菌感染与诊断（二）分子生物学技术直接测序厌氧菌感染与诊断测定未知或鉴定不出的微生物直接测定无菌标本中的微生物

测序结果1

腹水

脆弱拟杆菌2

腹水

嗜麦芽窄食单胞菌3

腹水

活泼瘤胃球菌+粪肠球菌4

房水痤疮丙酸杆菌5

房水

肺炎链球菌6

房水

里昂葡萄球菌7

脑脊液

脑膜炎奈瑟菌8

胸水

缓症链球菌9

膀胱穿刺液人型支原体优点：方便，准确性高，可用

10膀胱穿刺液

人型支原体11膀胱穿刺液

牛棒状杆菌+屎肠球菌于检测多种微生物。缺点：通量小。12膀胱穿刺液淋病奈瑟菌核酸探针技术厌氧菌感染与诊断将已知核苷酸序列DNA片段用同位素、或非放射性方法标记，加入已变性的的被检DNA样本中，在合适的条件下与样本中有同源序列的DNA片段形成杂交双链，再借探针上的标记物质分析样本中目的核酸片段，从而鉴定样本中未知微生物的种类。优点：特异性强，可用于检测多种病原微生物，沙门菌、产肠毒素大肠埃希菌、乙肝病毒缺点：敏感性较PCR扩增法低。PCR技术-FQ-PCR厌氧菌感染与诊断

实时荧光定量聚合酶链反应（real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,FQ-PCR）在PCR反应体系中加入可与DNA结合的荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的变化实时检测PCR过程中扩增产物量的变化，结合标准曲线对未知模板进行定量分析。

优点：特异性强，敏感度高，重复性好

缺点：只能针对特定的病原微生物进行鉴定，HBV、HCV、HPV、难辨梭菌、PCR技术-多重PCR厌氧菌感染与诊断

多重PCR（mutiplex

PCR）：在同一反应体系内加入2对以上的引物，同时扩增多个核苷酸片段。主要用于多种病原菌（腹腔、胸腔等部位厌氧菌的混合感染）的同时检测或鉴定分型。

优点：不仅具有PCR的特异性和灵敏度，而且更具高效性、系统性、简便经济性。

缺点：敏感性较低，扩增效率不高，引物间的干扰。PCR技术-单链构象多肽性分析厌氧菌感染与诊断

SSCP（singlestrandconformationpolymorphism）利用DNA单链构象具有多态性的特点，进行基因检测的一种分析技术。首先用PCR技术扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，再进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后根据SSCP电泳图谱进行分析。

优点：PCR-SSCP技术操作简单，无需专门的仪器，且敏感性高。PCR技术-限制性片段长度多态性分析厌氧菌感染与诊断

限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism，

RFLP）根据不同细菌基因组DNA的酶切位点和数量不同，在限制性酶切后形成大小不等的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离，从而显示不同种群细菌基因组DNA多态性。

优点：RFLP技术快速、敏感。

缺点：但不同的细菌适合的限制性内切酶不同，只能针对特定的病原体进行分型鉴定。而且任何可以引起酶切位点改变的情况，如点突变和一段DNA的重新构造等均可导致RFLP电泳图谱的改变。PCR技术-焦磷酸测序技术厌氧菌感染与诊断

焦磷酸测序技术是基于序列合成原理的DNA序列测定技术。引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上的每一个三磷酸脱氧核苷酸聚合与一次荧光信号释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列，达到测定DNA序列的目的。

优点：操作简单、高通量、速度快、重复性和精确性好，无需标记，无需电泳。

缺点：不适合检测分型长于100bp的DNA序列。PCR技术-恒温扩增技术厌氧菌感染与诊断

Q复制酶反应（QBRA）

链置换扩增技术（SDA）

切口酶恒温扩增技术（NEMA）

转录依赖的扩增技术（TAS、TMA、3SR、NASBA）

解旋酶扩增技术（HDA）

滚环扩增技术（RCA）

环介导等温扩增技术（LAMP）

单引物等温扩增技术（SPIA）基因芯片厌氧菌感染与诊断

基因芯片（gene

chip），又称DNA微阵列（DNAmicroarray），是通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。该技术采用显微点样技术，将已知序列的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与样本进行杂交。其中每一个分子的位置及序列均为已知，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，通过基因芯片扫描仪对荧光信号进行检测和分析，达到检测的目的。

优点：高通量、多样性、微型化、自动化，可同时多种病原菌进行检测，快速简便，特异性强。生物传感器技术厌氧菌感染与诊断

生物传感器技术（biosensortechnique）是将传感技术与分子生物学诊断技术相结合而形成的一门新技术。原理：待检物质进入生物材料，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学转能器转变成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可知待检物的含量。

生物传感器包括光学生物传感器、压电生物传感器和电化学生物传感器等。

优点：尤其是光化学生物传感器广泛应用于病原微生物的检测，有其独有的选择性和灵敏度。厌氧菌感染与诊断（三）其他厌氧菌检测技术厌氧菌的色谱分析鉴定厌氧菌感染与诊断固相微萃取（SPME）+气相色谱（GC）分析：标准菌株和临床感染菌株预先进行液化和盐析处理，固相微萃取后进行气相色谱分析，根据其各种挥发酸（包括短链脂肪酸）的种类和峰值，与标准的色谱带进行分析比较，判断待检细菌的种类。厌氧菌感染与诊断（四）艰难梭菌的检测进展艰难梭菌的概述厌氧菌感染与诊断

艰难梭菌（Clostridium

difficile

）是一种普遍存在的革兰阳性厌氧菌，可在健康人胃肠道定植，经粪-口传播，它是导致抗生素相关性结肠炎的主要病原菌。

艰难梭菌感染（CDI）在医院内抗生素相关腹泻（AAD）

病因中占１５％

～２

５％，患者临床表现轻重不一，轻者为自限性腹泻，重者可以发展至中毒性结肠炎，甚至死亡。

广谱抗菌药物的使用被认为是引起ＣＤＩ

的主要高危因素。几乎所有的抗菌药物均与ＣＤＩ

的发生有一定关系，其中最重要的药物包括克林霉素、青霉素、头孢菌素和氟喹诺酮类。艰难梭菌检测——培养厌氧菌感染与诊断

培养是所有检测中最灵敏的方法。

初代培养：选择性培养基——环丝氨酸-头孢西丁果糖平板（CCFA），厌氧环境，培养48h，形成表面粗糙、边缘不齐、较大的黄色菌落，紫外灯照射下可见黄绿色荧光。

耐氧试验

鉴定

毒素检测艰难梭菌检测——毒素检测厌氧菌感染与诊断致病性的艰难梭菌可以产生毒素A（肠毒素）和毒素B（细胞毒素）。艰难梭菌毒素A和B的检测主要是通过对疑似病例的粪便中毒素的检测完成。细胞毒素测定（CTA）：

CTA中毒素B的检测被认为是艰难梭菌检测的金标准。

到将培养的细胞暴露到有或者没有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物样本是艰难梭菌阳性，则对没有经过抗毒处理的培养细胞有毒害作用。酶免疫测定（EIA）：采用特异性抗毒素A和B的抗体，直接检测毒素存在。艰难梭菌检测——分子检测厌氧菌感染与诊断

艰难梭菌进行分子检测，能够直接从粪便样本中检测tcdB、tcdA、或Cdt

基因，证实产毒艰难梭菌的存在，具有检测快速（0.5-3h）、准确性高的优势。

实时PCR敏感度为89%-92%，优于EIA，而特异性相相当。但针对同一患者7d内重复PCR检测在临床上没有实用价值。PCR的不足之处在于不能区分定植与感染，产毒素的艰难梭菌检出率在普通人群中约为２

％，在住院患者中为7%-25%。因此，指南推荐PCR仅用于出现腹泻的患者，否则容易出现假阳性。厌氧菌感染与诊断四、厌氧菌体外药敏试验药敏临床意义厌氧菌感染与诊断厌氧菌的感染率高及时控制厌氧菌感染减少厌氧菌耐药菌株的产生了解厌氧菌耐药性的变迁临床意义厌氧菌感染与诊断随着抗厌氧菌药物的大量应用，厌氧菌对抗生素的耐药性也呈上升趋势。部分脆弱拟杆菌对甲硝唑的MIC>128绝大多数脆弱拟杆菌、部分普雷沃菌和梭杆菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药（二）体外药敏实验指征厌氧菌感染与诊断

严重的深部感染(脑脓肿、肺脓肿、腹腔

感染、心内膜炎、骨髓炎、关节炎、修复物或移植的血管感染，以及菌血症等)

慢性感染

经验用药无效

新药评价

耐药性监测抗菌药物选择厌氧菌感染与诊断根据细菌的种类和本地区、本单位常用抗菌药物的种类，选择体外药敏试验的药物。试验药物分为首选药物和次选药物。均敏感时，应先选择首选药物。首选药物耐药或病人对首选药物过敏时，再选择次选药物。抗菌药物选择厌氧菌感染与诊断首

选

药

物-内酰胺酶阳

-内酰胺酶脆弱拟杆菌产气荚膜梭菌、格

其它梭状兰阳性无芽孢杆菌、

芽孢杆菌消化链球菌性阴性氨苄西林/舒

氨苄西林/舒

青霉素/氨

青霉素/氨苄西林

青霉素/氨苄西林巴坦巴坦苄西林头孢西丁/头

头孢西丁/头孢替坦

孢替坦头孢西丁/头孢替坦克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素甲硝唑克林霉素亚安培南/美

亚安培南/美洛培南

洛培南亚安培南/美洛培南甲硝唑甲硝唑甲硝唑甲硝唑抗菌药物选择厌氧菌感染与诊断次

选

药

物-内酰胺酶阳

-内酰胺酶脆弱拟杆菌产气荚膜梭菌、格

其它梭状兰阳性无芽孢杆菌、

芽孢杆菌消化链球菌性阴性头孢唑肟/头

头孢唑肟/头

头孢西丁/

头孢西丁/头孢替

头孢唑肟/坦孢曲松孢曲松头孢替坦头孢曲松氯霉素氯霉素头孢唑肟/头孢曲松哌拉西林曲伐沙星四环素哌拉西林/

哌拉西林/替卡西

哌拉西林/替卡西林替卡西林林曲伐沙星曲伐沙星试验方法厌氧菌感染与诊断琼脂稀释法肉汤稀释法E-test法试验方法—琼脂稀释法厌氧菌感染与诊断琼脂稀释法─NCCLS推荐方法将不同稀释浓度的抗生素加入已溶化的琼脂中。将待检菌株接种在含不同浓度的抗生素的平板上厌氧环境中孵育，观察细菌生长情况。抑制细菌生长的最低抗生素浓度即为MIC。试验方法—琼脂稀释法厌氧菌感染与诊断琼脂平板的要求

营养好：强化布氏琼脂，5%（v/v）溶解绵羊血、氯化血红素5

g/ml和1g/ml维生素K1。

新鲜配制：4C保存不超过7天，最好当天配制。

预还原。试验方法—琼脂稀释法厌氧菌感染与诊断试验菌株

临床分离菌株。

纯培养（分纯后）。

生长良好（最好是对数生长期）。

0.5个麦氏单位。试验方法—琼脂稀释法厌氧菌感染与诊断抗生素及其工作浓度

试验用抗生素应使用实验专用的标准品，不能使用临床治疗注射用的成品药。

制备抗生素原液：使用规定的溶剂和稀释剂。试验方法—琼脂稀释法厌氧菌感染与诊断制备抗生素原液所用的溶剂和稀释剂抗生素溶剂稀释剂阿莫西林/替卡西

磷酸盐缓冲液，林，克拉维酸

pH6.0,0.1mol/L同前同上氨苄西林磷酸盐缓冲液，pH8.0,0.1mol/L头孢替坦