上海市临检中心 临床微生物检验学习班课件 微生物质谱应用体会 -陈蓉

微生物质谱应用体会上海市临床检验中心

陈蓉主要内容•

MALDI-TOF

MS工作原理•

MALDI-TOF

MS工作流程及注意事项•

MALDI-TOF

MS的运行MALDI-TOF

MS工作原理MALDI-TOF

MS工作原理离子检测器进入质量分析器电场蛋白质离子质量分析器基质和样品气化，形成带电离子激光激光基质样品离子源样品靶板单个样品点MALDITOFMS蛋白质指纹特征MALDI-TOF

MS蛋白质指纹特征•

X轴：M/Z•

Y轴：相对强度微量

准确

快速

廉价MALDI-TOF

工作流程样品制备采集谱图菌种鉴定添加基质室温干燥步骤

1:样品制备步骤一：样品制备直接涂抹法纯分出单一菌种挑取单一菌落涂抹于样品盘上加上

1

μl

基质溶液（α氰4羟肉桂酸

HCCA）步骤一：样品制备扩展的直接涂抹法纯分出单一菌种挑取单一菌落涂抹于样品盘上加上

1

μl

甲酸加上

1

μl

基质溶液（HCCA）步骤二：采集图谱步骤三：数据库比对鉴定分值微生物鉴定得分和含义系统配套软件数据库•

两套软件：IVD和RTC（科研/可自建数据库）•

数据库：常规数据库，分支杆菌数据库，丝状真菌数据库•

质谱数据库质量直接关系鉴定的准确与否，数据库有两种形式，一种为所有质谱图来自标准菌株，另一种除标准菌株外加临床分离株。步骤四：结果报告注意事项注意事项•

样品：纯菌，涂抹要均匀，使用很少量的微生物样品。•

标本直接鉴定：前处理方法（去杂质，如分离、高速离心）•

基质：质谱纯、新鲜配置，用量与模板匹配。•

采取措施避免错误定位样本：样本及其在MALDI靶板上相应的样本位置经过确认和记录。注意事项•

检查要使用的MALDI靶板表面上是否存在严重刮伤：否则基质液容易溢出到另一孔位置中，交叉污染。•

对于每个样本，使用新枪头至关重要，以避免交叉污染。•

靶板处理：水浸泡后按程序清洗•

仪器保养：保洁最重要•

激光光源有寿命，节约使用MALDITOFMS的性能验证•

培训•

性能验证•

使用心得培训培

训培训内容：原理，操作，软件培训人员要有资质，5天培训获得培训证书结核杆菌、丝状真菌对蛋白提取与生物安全要求高性能验证新进设备启用前（发报告）需要性能验证性能验证几次？一次性能验证报告：计划和总结性能验证报告性能验证报告计划MALDI-TOF

质谱仪性能验证计划一、目的对新进的MALDI-TOF质谱仪进行性能验证，评价其用于常规微生物细菌快速鉴定是否有效。二、菌株的来源1.1参考菌株：实验室保存的ATCC标准菌株，卫生部发放的EQA质控菌株及CAP的质控菌株。种类包括：需氧菌、厌氧菌、酵母菌。使用的菌株尽可能涵盖多的属。1.2临床菌株：来自医院的临床菌株。种类包括：需氧菌、厌氧菌、酵母菌。三、性能验证试验方法1.参考菌株：取出冷冻库存菌株，进行2次以上的培养传代后，将18-24小时新鲜生长的单一菌落用BRUKER

MALDI-TOF质谱仪进行鉴定，其鉴定结果与已知菌名进行比较。2.临床菌株：临床标本由三级医院提供，质谱仪和现有的VITER同时对临床菌株进行鉴定，两者的结果进行比较。鉴定结果两者有差异的，以现有的鉴定系统结果为准。若菌落形态有明显差异，可用其它鉴定方法进行再确认。四、细菌鉴定能力判断标准1.参考菌株：BRUKER

MALDI-TOF质谱仪与已知结果比较，其准确性需达到100%。2.临床菌株：BRUKER

MALDI-TOF质谱仪与现有鉴定系统结果比较，其准确性需达到90%以上。性能验证报告小结1.参考菌株鉴定结果Bruker质谱仪一共对170株参考菌株进行了细菌鉴定，其中58株为卫生部和CAP的质控菌株（表1），112株为标准菌株（表2）。Bruker质谱仪株参考菌株鉴定结果符合性数量（株）质谱仪鉴定率（%）标本来源质控菌株标准菌株56/56100%100%100%参考菌株109/109165/165合计•

2株质控菌志贺氏菌株（痢疾志贺菌、福氏志贺菌），质谱仪鉴定的结果为大肠埃希菌。•

缓症链球菌A6249鉴定结果为口腔链球菌。•

福氏志贺菌A12022、鲍氏志贺菌A9207鉴定结果大肠埃希菌。•

拟态弧菌、快生长分支杆菌鉴定率低，低于1.7分值。•

1株EQA1605号细菌，卫生部公布的结果为洛菲不动杆菌，梅里埃鉴定系统的结果为洛菲不动杆菌，而质谱仪检测结果为约氏不动杆菌。经测序结果为约氏不动杆菌。性能验证报告小结2.临床菌株鉴定结果Bruker质谱仪对39株临床株进行细菌鉴定（表3）。Bruker质谱仪临床菌株鉴定结果符合性标本来源临床菌株数量（株）

质谱仪鉴定率（%）39/39100%1株细菌梅里埃无鉴定结果，Bruker质谱仪鉴定结果为孔氏创伤球菌，经测序结果显示为孔氏创伤球菌。质谱仪检测结果和测序结果一致。质谱仪梅里埃测序-孔氏创伤球菌孔氏创伤球菌MALDI-TOF

质谱仪按照验证计划进行试验，涉及的细菌有53个属，127种细菌（见表4）。经验证MALDI-TOF

质谱仪在细菌鉴定方面，重复性好，可靠性高，应用范围广，在需氧菌、厌氧菌、真菌方面有很好鉴定结果。同时实验操作方便，数据可资料备份、可中文报告。能够满足临床微生物常规的细菌鉴定要求；软件包含临床体外诊断和科研二套系统，满足需求。心得体会心得体会•

鉴定分值：部分G+细菌和真菌鉴定分值低，仍可用。•

近缘菌分辨率不