上海市临检中心 PCR培训课件 1、倪培华-分子诊断技术基本原理及常见方法

分子诊断技术基本原理及常见方法上海交通大学医学院检验系倪培华分子诊断策略一般性检出策略提供是否存在某种病原体感染完整性检出策略分型耐药性常用的分子生物检测方法基因扩增随机扩增多态性DNA重复序列PCR限制性片段长度多态性分析（RFLP）核酸杂交DNA序列分析基因芯片……..§

聚合酶链反应(Polymerase

ChainReaction

,PCR)PCR反应的特点对标本的纯度要求低特异性强灵敏度高

简便、快速整个PCR操指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平作过程，从标本处理、PCR扩增到产物分析，可在4h内完成全部实验引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性DNA

粗制品及总RNA均可作为扩增模板DNA体内外复制PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制的步骤变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR基本组成其他DNA聚合模板酶引物脱氧核糖核苷酸30次循环后靶序列扩增的数量No.of

No.

AmpliconCycles

CopiesofTarget1cycle=2

Amplicon122cycle

=4Amplicon3cycle

=8

Amplicon244cycle=16

Amplicon384165cycle

=

32

Amplicon5326cycle

=64

Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247cycle

=

128

AmpliconPCR扩增过程图示CYCLE

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA100%

EFFICIENCY

90%

EFFICIENCY

80%

EFFICIENCY

70%

EFFICIENCY012312481612471312361012358AFTER

1CYCLE45678326412825625478917032361319346111019835764314

100%=2.00x244190%

=1.90x80%

=1.80x70%

=1.70x7011920234358399095121011121314151617181920212223242526272829301,0242,0484,0968,1921,1652,2134,2057,9901,1572,0823,7486,74716,38432,76865,536131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,6842,8624,8668,27215,18128,84454,804104,127197,842375,900714,2091,356,9982,578,2964,898,7639,307,65017,684,53433,600,61563,841,168121,298,220230,466,61812,14421,85939,34670,824127,482229,468413,043743,4771,338,2592,408,8664,335,9597,804,72614,048,50625,287,31145,517,16014,06323,90740,64269,092117,456199,676339,449577,063981,0071,667,7112,835,1094,819,6868,193,466•

以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物逆转录生成cDNA方式•

以oligo(dT)作为引物，mRNA3’末端polyA尾与之互补•

以人工合成的随机序列(6

bp)混合物作为引物引物的在线设计工具及免费软件简介WWW

GeneFisherhttp://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web

Primers/webprimers.htmlProject

DOPE2eractiva.de/NetPrimer/netprimer.htmlPrimers3http://primer3.ut.ee/设计沙眼衣原体引物（Chlamydiatrachomatis，CT）确定拟要研究的基因:CTGenbank中找到相应的基因序列采用引物设计软件进行引物的设计/确保引物的特异性，将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast

中核实/5’AATGCAAATCGTTTCCTTGC3’5’CGGAATTGTGCATTTACGTG3’AATGCAAATCGTTTCCTTGCCGGAATTGTGCATTTACGTG§

实时荧光定量PCR(real-time

quantitative

PCR)实时荧光定量PCR的特点灵敏度高特异性强可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单常用的荧光定量PCR方法SYBR

Green

ITaqman水解探针分子信标SYBR

GreenI

工作原理未结合的SYBRgreen

I•

结合到双链DNA的小沟部位•

只有与双链DNA结合后受到激发的时候，可以发出绿色荧光SYBR

Green

ISYBRGreenI

工作原理灵敏度高,使用方便非特异性产物融解曲线TaqMan

ProbesFAMTETJOE荧光素淬灭剂TAMRAHEX与目标序列互补TaqMan

探针的机理DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测TaqMan

Probes工作原理荧光基团淬灭剂游离的探针光能量转移另一波长的荧光Taq发出荧光光延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq分子信标(发夹型杂交探针)分子信标(发夹型杂交探针)Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号3.002.502.001.501.000.500.00与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比10

10

10432Threshold初始DNA量越多,

荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40Cycle起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量定量PCR§

随机扩增多态性DNA(randomly

amplified

polymorphic

DNA

,RAPD)

随机合成8-12

bp寡核苷酸(多为10

bp)作为引物

低退火温度PCR，使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合形成扩增产物

扩增循环次数一般为35-45

特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型§

重复序列PCR（repetitive

sequence-based

PCR，Rep-PCR）

利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为靶序列进行PCR

细菌菌株分型的重复序列有10多种

基因外重复回文序列（Rep）

肠细菌基因组间共有重复序列（ERIC）

在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的差异，而序列本身在进化过程中又具有高度保守§

限制性片段长度多态性分析(restricted

fragment

length

polymorphism，RFLP)

限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA切割，进行凝胶电泳，依片段大小不同将其分离

不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，产生的DNA片断长度呈现多态性现象

传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern印迹杂交，应用该方法可以构建DNA指纹图§

Southern

Blot§

DNA序列分析(DNA

sequencing)ddTTPDNA序列分析DNA链