上海市临检中心 PCR技术人员上岗培训班课件 分子病理检测及其质量控制 周晓燕

分子病理检测及其质量控制复旦大学附属肿瘤医院病理科

周晓燕2017-04-11

上海分子病理是精准医疗的重要部分精准医疗：是一种新型医疗方式基因、

个体化差异环境生活方式预防、诊断、治疗精准医疗计划:精准医疗概念进入临床实践分子病理快速发展‹

分子设备及技术快速发展‹‹‹驱动基因不断鉴定各种分子标志物不断发现——

临床需求越来越多

：

“快”、“准”，“全”——需要分子病理与个体化治疗共同发展肿瘤诊断模式的改变Multi-step

dignosisSingle-step

diagnosis经验证据，

主观客观形态分子，

定性定量分子病理基础和主要应用易感性/外周血根据疾病与基因异常的关系遗传性/（有核细胞）毒副作用正常组织手术标本诊断分型靶向治疗预后判断分子生物学分子遗传学异常技术D蛋N白ARNA细胞学标本外周血为病理诊断、临床治疗提供更多有价值的信息！疗效监测（CTC）（ctDNＡ）耐药机制ꢀꢀ..分子病理诊断已应用到常见肿瘤‹

肺癌淋巴瘤‹‹‹‹‹‹‹‹‹‹结直肠癌乳腺癌淋巴瘤软组织肿瘤卵巢癌黑色素瘤甲状腺肿瘤脑肿瘤‹ꢀꢀꢀꢀ..分子异常形式决定技术平台‹染色体异常——

易位/倒转/缺失/插入/重复基因修饰异常——DNA甲基化/组蛋白乙酰化‹‹‹基因结构异常——重排(基因内、外）/扩增/突变/MSI——mRNA——根据异常形式，选择恰当的技术平台分子病理技术异常形式可用技术基因扩增FISH/SISH/CISH,

基因芯片、二代测序

…….染色体分析，FISH，RT-PCR、二代测序

…….染色体易位/基因融合基因突变DNA测序，ARMS，焦磷酸测序、ddPCR、二代测序….DNA拷贝数/mRNA

ISH、荧光定量PCR、基因芯片、二代测序

…….基因重排DNA片段分析、二代测序微卫星不稳定

DNA片段分析、二代测序甲基化MSP、焦磷酸测序、seqemeon

、二代测序

…….多基因异常基因芯片、nanostring、seqemeon、二代测序

….8分子病理流程和基本技术平台组织标本准备切片选择、病理质控切片核酸提取检测ISH/FISH/SISHPCR

based46主要内容‹

FISH检测及其应用‹

PCR为基础的相关技术及其应用‹

FISH及PCR相关检测的质量控制10主要内容‹

FISH检测及其应用‹‹

分子检测中的质量保证和质量控制11FISH检测的原理直接：探针直接标记荧光素

间接：探针标记生物素/地高辛-间接抗XXX荧光素荧光显微镜下观察FISH检测的主要应用ò基因扩增（

HER2、METꢀ）（ALK、ROS1、EWSR1、òBCL1ꢀ）ò基因缺失(PTEN、1p/19qꢀ)FISH法检测Her-2基因扩增ò乳胃腺癌癌：：25%-30%ò10%-30%乳腺癌Her-2/neu基因状态的意义ò

预后因子：无论淋巴结状态如何ò

预测因子：内分泌治疗HER2阳性患者相对耐药C紫M杉F类方药案物H相E对R敏2阳感性患者相对耐药蒽环类对大剂量蒽环类相对敏感ò

靶向治疗靶点：Her-2状态指导靶向治疗2013HER2

ISH

判断流程及主要更新点双探针：比值的阈值改变HER2拷贝数结合阈值和拷贝数两个参数胃癌中HER2状态及其临床价值ò胃食管交界处和胃曲妥珠单抗治疗显著延长生存期òòòò进展期胃癌靶向治疗患者筛选、疗效预测依据胃癌HER2检测指南(2011版)胃癌的HER2检测流程IHC阴性不确定阳性0/1+2+3+报告为报告为HER2阴性HER2阳性ISH不适合治疗适合治疗FISH/(D)SISH/CISH胃癌中HER2阳性特点ò与组织学类型相关：肠型、混合型、弥漫型ò与肿瘤部位相关：胃食管交界处、胃中2+的病例比例可能高òIHC

ISH

——30%ò

IHCò与标本类型有关：

手术标本>活检òIHC和FISH不一致更多见，IHC阴性：报道7.5%ISH阳性FISH检测的重要环节•

方蜡法块选择：单探针/双探针?探针性能•

检测过程：活检/手术？冰冻/石蜡？原发/转移？（手工、全自动）•：切片-脱蜡-水化-消化-杂交-洗涤-封片•

结果判读：质量、区域、计数、结果报告及其解释计数细胞核选择大小一致；胞核边界完整；DAPI染色均一；细胞核无重叠；至少20个癌细胞核中的双色信号CEPl7绿色信号清晰

；融合或簇状信号数估计Images

from

FUSCC阴阴性，多性倍体阳阳性性FISH在检测染色体易位中的应用‹基肿础瘤：淋非巴随瘤机、性软染组色织体肿异瘤常、，肺与癌类、型甲有状关腺肿瘤‹应用：

诊断、分型、靶向治疗‹易位的模式图9号染色体22号染色体检测易位的探针类型•

融合探针•

分离探针淋巴瘤中的频发特异染色体异常淋巴瘤类型非随机染色体异常涉及基因CLL/SLLDel

13q14unknownTrisomy

12unknownDel

11q22-23ATMDel

17p13TP53LPLt

(9:14)

(p13;q32)PAX-5/IGHMALT-MZLFLt(11;18)(q21;q21)CIAP2/MLTt(1;14)(p22;q32)BCL10/IGHt(14;18)(q32;q21)IGH/MALT1t(14;18)

(q32;q31)BCL-2/IGHMCLt(11;14)(q13;q32)cyclinD1/IGHDLBCLBLt(3q27)BCL6t(14;18)(q32;q21)BCL-2/IGHt(8;14)(q24;q32)myc/IGHt(2;8)(p11;q24)IGLK/myct(8;22)(q24;q11)myc/IGLLALCLt(2;5)

(p23;q35)等ALK/NPM套细胞淋巴瘤的诊断ò特征性

t（11；14）

（BCL1-IGH）

95%，

少数：

IGK，IGLt(11;14)

+t(11;14)

-61M，

（十二指肠球部、升结肠、横结肠）

活检组织小而破碎IGH/CCND1Dual

Color,

Dual

Fusion

Translocation

Probe侵袭性B细胞淋巴瘤的鉴别诊断舌根部肿块，54F

:

DLBCL?Burkitt?

DH-BL?

治疗和预后不同MYC分离探针分离探针融合探针BCL6BCL2-IgHMYC

基因易位

+

BCL6

基因易位

+

BCL2

基因易位

-°

最后诊断:

Double-Hit淋巴瘤软组肿瘤织类型肿瘤中的频发特异染色体异常Synovial

sarcomaEwing's

sarcoma/Primitive–––––––––neuroectodermal

tumorClear-cell

sarcoma–Extraskeletal

myxoid

chondrosarcomaDesmoplastic

small

round

cell

tumor–Myxoid/round

cell

liposarcoma–––Alveolar

rhabdomyosarcoma–Dermatofibrosarcoma

protuberans–Congenital

fibrosarcoma––Alveolar

soft

part

sarcoma––Inflammatory

myofibroblastic

tumorLow-grade

fibromyxoid

sarcoma––软组织肿瘤诊断与鉴别诊断23岁，

男，

右腋窝肿块，形态多样内对照SYT-SSXSYT-SSX1SYT-SSX2SYT-FISH+°

最后诊断:滑膜肉瘤(synovial

sarcoma)主要内容‹

FISH检测及其应用‹‹

分子检测中的质量保证和质量控制34PCR及分析技术‹PCR-凝胶电泳：特异性片段、片段大小‹PCR-毛细管电泳：序列分析、片段长度分析：多基因突变、易位、表达等‹

PCR‹NGSmRNA•

其他相关技术：DHPLC，

PCR-SSCP。。。。。PCR-凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳PCR法检测淋巴瘤中克隆性重排ò不同的淋巴细胞，相同的重排形式，淋巴细胞单克隆性增生ò

确定恶性克隆的存在，是淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标ò应用：

诊断与鉴别诊断；谱系确定；分期,外周血、骨髓累及克隆相关性判断PCR法---最常用的克隆性重排检测方法1.

聚丙烯凝胶电泳法分析2.基因扫描分析基因重排的应用66M,胃黏膜活检43F,

左腮腺肿块明显的浆样分化细胞基因重排的应用胃黏膜活检标本：

FR1(+),FR2(+),

FR3(+)诊断：

（胃）小B细胞淋巴瘤，倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤左腮腺肿块：FR1

(+),FR2(+),

FR3(-)诊断：（左腮腺）符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤毛细管电泳基因扫描（genescanning）ò

敏感òòò快速分辨率高可获得更多信息——具有优势PCR-毛细管电泳的应用——片段分析（基因扫描）、突变分析手术标本活检标本胸水等细胞基因扫描图测序分析图谱DNA

抽提**PCR是关键：产物长度--------特异性建议通用测序引物PCR扩增必要时巢式遗传分析仪PCR产物电泳PCR产物纯化R基因扫描在克隆性重排分析中的应用单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈分布。IGH-AIGH-BIGH-CIGK-AIGK-B阴性对照78F,

胃窦、胃底活检组织，

组织较小，

CD20+、CD79+、bcl6+、κ+、Ki67

95%等结合形态、IHC

和基因重排检测诊断为DLBCL微卫星不稳定(MSI)检测的临床价值ò

遗传性非息肉性结直肠癌

(HNPCC)筛选：——有结直肠癌家族史的患者应做MMR或MSI检测。——若IHC-MLH1蛋白缺失，还需检测BRAF突变ò——分化差的病理类型如果伴有MSI-H则不认为是高危因素——II期病人伴有MSI-H时预后好——不会从5-FU辅助治疗中获益。ò

PD-1抑制剂是否获益的指标45MSI

分析ò检Pr测om方eg法a:单核苷酸重复panel:

5个单；或更多分别对同一病例的正常和肿瘤组织进行显微切割、核酸提2个及以上不稳定——MSI-HNCI:Bethesda

consensuspanel:2个单、3个双；ò

判断个方不法：定

I

，或不

定1

稳

——MS

-L确没有不稳定——MSSMSI分析方法PCR-毛细管电泳图抽提正常和肿瘤组织

DNA提取

PCR反应毛细管电泳结果分析遗传分析仪PCR

扩增68F

直肠腺癌，

T4N0M0MSSD5S346D17S250D2S123Bat26Bat2573M，

左半结肠腺癌，T3N0M0，

MSI-HD17S250D2S123D5S346Bat26Bat25Sanger测序的检测内容和应用ò检测内容：点突变、小片段缺失、插入ò临床应用：结直肠癌中KRAS、NRAS和BRAF基因状态突变肺癌中EGFR、KRAS、ALK基因异常。。。。。胃肠道间质肿瘤（GIST）分子分型KIT80%散发，KIT/PDGFRAPDGFRA5-10%突变型（极少见家族性）SDHBIHC

缺失甲基化SDHA/B/C/D突变

散发、遗传，SDH缺陷型少数Carney-triadKIT/PDGFRA野生型NF1（少~1%）SDH非缺陷型BRAF（少~1%）其他基因：上述均阴性PIK3CA51胃肠道间质瘤中KIT和PDGFRA突变ò

功能获得性KIT突变：大多数-CD117阳性PDGFR突变：少部分ò——细胞表面酪氨酸激酶持续性活化，细胞增殖失控GIST中

KIT

和

PDGFRA

突变KITPDGFRA总突变率:

87.4%外显子

9(11%)细胞膜外显子

11

(67.5%)外显子

12(0.9%)外显子

13(0.9%)外显子

14(0.3%)细胞质外显子

17(0.5%)外显子

18(6.3%)GIST中分子病理应用ò协助诊断‹

疑难GIST:

c-kit或PDGFRA突变分析协助诊断族性GIST以及儿童GIST‹特殊类型GIST：NF1型、完全或不完全Carney’s三联症、家ò所有初次诊断的复发和转移性GIST，拟用分子靶向治疗‹

原发可切除术前拟用分子靶向治疗手术后，中

高度复发风险，拟用伊马替尼辅‹助治疗‹GIST-ò

二次突变检测‹继发性耐药需要重新检测KIT和PDGFRA突变检测范围ò原发性：，17，18‹PDGFRA:

Exon

12,

14，18‹KIT:

Exon

9,

11,

13,

14ò‹PDGFRA:Exon

14，18‹KIT:

Exon

13,14,17,18突变类型与发生部位有一定关系突变类型与imatinib的敏感性有一定关系突变类型与靶向治疗敏感性的关系突变位点对Imatinib的反应KIT突变Exon

11反应最好Exon

9反应中等Exon

13反应差Exon

17反应差PDGFRA无突变Exon

12反映敏感Exon

18D842V反应差,其余敏感反应差继发型突变对靶向治疗抵抗220230240250260270280290300310AGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTACAG------GTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTACAGTGGAAGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAACGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAACGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAA320330340350360370380390400410420CAACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTTtCCCAGAAACAGGCTGAGTTTTGGTCAGTATGAAACAGGGGCTTTCCATGTCAATGTCAATATGTTGGCTTTCGGCAACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTT-CCCAGAAACAGGCGAAGGC胃间质瘤：第十一外显子检出6个碱基纯合性缺失：c

1669-1674

delTGGAAG。该缺失可造成第557位密码子色氨酸（Trp,

W）和558位密码子赖氨酸（lys,

K）的缺失。一例小肠GIST中

KIT第9外显子突变：

可见

c.1504-1509

dup

GCCTAT

（杂合性），导致p.502-503dup

AY。

（上图为KIT基因第9外显子野生型序列，下图为该病例正向测序结果）结直肠癌是一组异质性肿瘤家族相关性‹散发性Sporadic遗传性-HNPCC、FAP等分

子‹机制Familial‹

染色体不稳定性

(CIN)：散发、遗传微卫星不稳定性

(MSI)

：散发、遗传‹

CpG岛的甲基子表型

(CIMP)：散发genomic

instability)‹分子分型epigenetic

instability)各种组合方式：5组、4组、7组等主要涉及：KRAS、NRAS、BRAF、MSI和CIMP状态尚无国际通用的标准的分子分型结直肠癌中分子病理应用RAS突变

靶向治疗获益人群的筛选预后价值尚不肯定BRAF突变

预后指标，突变者预后差并不从5-FU单药辅助治疗中获益PD-1抑制剂是否获益的指标遗传性结直肠癌筛选SNP、分子分型ꢀꢀ.60结直肠肿瘤生成中RAS的作用EGFR

(HER1)EGFTGF-αRAS基因家族HB-EGFEpiregulin与是否EGFR抑制无关K-RAS:

E2,3,4RAS突变导致持续信号激活，H-RAS：RAFMEKERKN-RAS:

E2,3,41.

De

Roock,

etal.Lancet

Oncol

2010

2.3.

Fernández-Medarde,

Santos.

Genes

Cancer

2011;

4.DeRoock,

etal.Lancet

Oncol

2011PRIME研究中

RAS/RAF分析‹

常见的KRAS外显子2基因突变以外，其他RAS基因突变（KRAS外显子和4，NRAS外显子2、3和4）约占总肠癌人群的10%3

野生型患者相比于外显子

野生型患者，帕妥木单抗联合的中位PFS从9.6月提高到10.1月，中位OS从23.9月提高到26‹

R月A（S有显著差异），而化KR疗A组S没有改2变。FOLFOXDouillard

JYetal.NEngl

JMed2013;369:1023-1034ò

所有转移性CRC都应该做肿瘤组织RAS和BRAF突变检测（KRAS+NRAS+BRAF)，

KRAS/NRAS:（E2+E3+E4）ò

与panitumub\cetuxmab敏感性有关ò原发灶、继发灶均可63RAS(KRAS+NRAS)

野生型预后更好KRASorNRASRAS突变是否是其他EGFR抗体预测指标尚待进一步研究Douillard

JY

et

al.

NEnglJMed

2013;369:1023-1034BRAF基因ò7q34，

18个外显子组成，783个氨基酸编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶òòò由三个保守区组成CR1、CR2、CR3

（激酶区）是RAS-RAF-MEK-ERK上游调节因子BRAF基因突变位点‹

80%：激酶功能域V600EBollag

G.NatRev

Cancer2007

Apr;7(4):295BRAF突变与结直肠癌的关系5%-9%ò与临床病理高危因素相关：近端、T4、低分化òò目前尚无证据证明其对靶向治疗的指导作用ò突变提示：体细胞MLH1甲基化，而非胚系基因突变正向结肠腺癌中KRAS基因突变：KRAS

12codonGGT>GAT

,p.G12DReal-time

PCR技术‹在PCR反应体系中加入荧光探针；‹实时监测整个PCR进程；‹定量和定性分析荧光探针非特异性荧光标记：1、SYBR

Green特异性荧光标记：1、TaqMan2、蝎形探针3.环形探针TaqMan---水解型杂交探针与目标序列互补‹

5′端标记有报告基团(Reporter,

R)

，如FAM、VIC等‹

3′端标记有荧光淬灭基团

(Quencher,

Q)‹

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光‹

Taq酶有

5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光ARMS法检测突变ARMS：amplification

refractory

mutation

system等位基因特异性PCR

+荧光探针=

ARMS方法突变正向引物延伸反向引物产生荧光信号ADNA突变正向引物无延伸反向引物野生DNA模板GReal-time

PCR技术的应用ò突变/SNP分析：ARMS、HRM等òRNA

:ARMS结果判读判读依据：ò阴性对照；G719Xòòò阳性对照；内对照；曲线形态；S768IòCT计算ò不同试剂盒有不同标准或可自动输出NSCLC中驱动基因异常NSCLC：

肿瘤驱动基因及相应靶向药物驱动基因检测：靶向药物选择和临床试验规范分子检测：是规范治疗的前提和保证òEGFRòKRASòALK

fusions

3-7%òHER2òBRAFòPIK3CAòAKT1òMAP2K1òNRAS广州省人民医院上海肿瘤医院胸外科-非吸烟腺癌òROS1

fusionsòKIF5B-RETEGFR和ALK检测主要共识‹

EGFR

&

ALK是NSCLC已知的“高频”驱动基因‹

EGFR、ALK异常患者接受相应靶向治疗，有效提高生存率‹

“先检测，后治疗”的NSCLC靶向个体化治疗模式已成为临床的诊疗‹

所有含腺癌成分的NSCLC需常规检测EGFR

&

ALK‹

对于小活检标本或者不吸烟的鳞癌患者也建议进行。Kris

MG,

et

al.JAMA

2014;311:1998-2006EGFR突变与临床、病理NSCLC

生ò主要发

于腺癌和腺鳞癌：不吸烟、亚洲、女性常见ò

鳞癌、神经内分泌癌、粘液性癌：少见SCC临床特征：不作为选择分子检测的依据组织学亚型：可作为分子检测的筛选基础推荐所有含腺癌成分的NSCLC进行检测小标本鳞癌也建议检测78EGFR基因TK区突变三类突变形式：ò框错架义内突缺变失：：Exon19

delòò插入突变：Exon2018-21òExon19、：2最1重：

要最

突常

变见一半为原发性耐药òE一xo半n2为0

获得性耐药

-T790MCheng

L

et

al.Modern

Pathol2012;25:347-36979EGFR基因突变检测方法任何检测DNA

突变的方法采用PCRbased

技术，具有敏感性和特异性IHC检测突变蛋白和FISH法检测EGFR拷贝数——都不是作为TKI患者筛选的指标！EGFR突变检测方法列E出M3Q2N中数方据法我国PQCC数据ò80%

ARMSò20%测序和其他òSanger

DNA

sequencingò

ARMSò

HRMòNextGen

sequeningòTaqman,Cobas测序法与ARMS法比较测序法敏感度10-30%AR1M%

SFFPE标本成功率低高检测流程复杂、长简单快速数据分析要求高低突变类型已知和未知已知假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低高肺癌中多基因异常、多靶向治疗近10

年来已发现肺腺癌的一系列驱动基因改变，并有相应靶向药物。EGFRROS1突变重排Erlotinib,

Gefitinib，afatinibCrizotinibALK重排Crizotinib,

AlectinibMET

扩增,exon14Δ

CrizotinibHER2突变Afatinib，Dacomitinib,

CO-1686KRAS突变Selumetinib，TrametinibBRAF突变Dabrafenib,trametinibRET重排cabozatinib全程化分子检测需求ò初次治疗

——

耐药进展（EGFR、ALK等）

（T790耐药）ò组织、外周血——

外周血、组织NGS因其优势进入临床应用技术平台定量通量

检测基因变异类型否低扩增，融合FISH免疫组化半定量

低融合，高表达（Sanger）定量PCR是中热点突变，融合，高表达二代测序（NGS）是高所有突变，扩增，融合，高表达NGS：

高通量、高灵敏度、节约样本、低碱基成本主要内容‹

FISH检测及其应用‹‹

分子检测中的质量保证和质量控制86质量保证和质量控制检测前检测中检测后保证过程有效合理保证结果（质Q量A保证）室间质评室内质控准确可靠（质Q量C控制）重要质控点、注意事项‹检测方法性能参数的确立标本类型、病理质控重视组织前处理对分子检测的影响‹‹‹‹‹‹‹‹检测中的各种对照设立/判断标准、结果注释多平台建立、对照参加室间质评样本和数据管理88性能参数的验证或确认‹分析敏感性

（analytic

sensitivity)‹‹‹分析特异性

（analytic

specificity)准确性

（accurcy）precision89标本来源及形式手术标本石蜡切片组织蜡块FFPE细胞蜡块4-5umctDNA/CTC是重要补充‹手术标本最理想；标本质量很关键；规范检测很重要！‹‹样本类型ò

手术切除标本——首选、最可靠重要来源细胞学标本：ò活检小标本：ò穿刺细胞，脱落细胞

（胸水、支气管刷取物、痰液等）——细胞蜡块：可提高阳性率病理质控基于组织的分子诊断，病理评估不可缺少；‹

标本来源、标本类型细胞百分比、或细胞量‹（必要时进行细胞富集）‹——与结果密切有关92病理质控流程组织标本接收组织处理、蜡块和H&E染色切片制作蜡块未染色切片H&E染色切片去除标记以外的区域病理质量控制和显微切割质量达标质量不达标基因突变不能进行基因检测突变检测确定标本类型、肿瘤特征分布乳腺癌胃癌HER2FISH计数区域选择胃癌的两个区域检测前处理中主要环节组织消化提取ISH固定、切片PCRDNA/RNA固定目的‹学上离可体见后的组细织胞改器变变：化活

和体

细组

胞织

组一

织旦的停形止态血

改供变，直物至质自代溶谢。就会产生一系列的生物化学和组织化学改变，并导致形态‹免疫固化定学目成的分：应用中性缓冲福尔马林液，仅可能地保存良好的固定是切片、免疫组化、分子病理检测成功的基础组织细胞离体时具有的生理和病理形态结构、生物化学、良好的固定‹及时固定：EGFR/KRAS规范中：

离体20~30分钟内固定。HER-2规范中：离体1小时内固定‹固定液：10%

中性缓冲福尔马林液，避免使用酸性及含有中金属离子固定液处理标本。固定液的量应为组织的10倍。‹固定时间：EGFR/KRAS检测规范中活检标本：6-12小时手术切除标本：6-48小时HER-2

ISH检测规范中：

6-72小时组织脱水和包埋‹

充分脱水‹

石蜡熔点应低于60oC,避免长时间置于融化的石蜡中‹

使用新鲜石蜡，并定期更换；切片、脱蜡‹切片厚度：

ISH——

4-5um；同一实验室统一脱蜡：彻底，不彻底会影响监测结果PCR——常规或厚切片‹——保证脱蜡时间，定期更换二甲苯和酒精HER2-FISH操作过程中的关键环节福尔马林固定,定片固

？切

厚度？石蜡包埋组织切片标本脱蜡至水PHFISH探针杂交杂交时间和温度？洗脱洗脱时间和温度？封片切片及信号质量?荧光显微镜下观察101结果判断前的质量检查不接受病例：‹无肿瘤细胞或肿瘤细胞不足;细胞核不完整：细胞核边界不清，或细胞核内空洞，‹太厚，细胞重叠;过渡消化;‹‹信号太弱;非特异染色‹有信号细胞<75%;‹•一旦发现染色结果未达到要求，则不能判读，必需重新制片和染色良好的前处理阴性阴性，多倍体不良前处理对FISH检测的影响周五标本为多，尤其是小标本（乳腺空芯针、肺活检、穿刺细胞块——固定时间长对分子病理检测影响很大石蜡标本核酸质量检查‹DNA定量：nanodrop,

Qubit,QPCR‹DNA纯度

：OD值‹DNA完整性——是影响结果的重要因素良好的前处理IGH-AIGH-BIGH-CIGK-AIGK-B阴性对照不良前处理对基因重排检测的影响‹内对照仅显示

100bp~200bp,

DNA降解‹DNA量低，峰低‹各管或某些管无扩增，无法判断。没有及时固定和固定时间长——是影响质量的重要因素DNA质量对基因重排检测的影响内对照300bp，FOXL2测序成功；内对照200bp弱，FOXL2测序均不成功PCR检测中“无基因、无核酸”措施ò实验室分区:ò切片：切片和水的更换òDNA提取及操作：ò

桌面及产物处理：室内质控内容监控本次操作全过程、确保项目稳定可靠病理质控DNA质量评估òòò每次每次对照设立：每次阴性、弱阳性（