上海市临检中心 临床微生物学检验新技术及质量控制学习班课件 高通量多重基因检测系统在感染性疾病诊断中应用

上海市临检中心微生物检验与质控学习班高通量多重基因检测系统在感染性疾病诊断中应用赵

虎华东医院2018-6-6报告内容1感染性疾病诊断的现状多重基因检测系统建立幽门螺杆菌鉴定与药敏23腹泻病原体的检测分析脓毒症病原体检测分析45一、感染性疾病诊断现状细菌感染诊断的金标准——分离培养明确是否有感染——诊断金标准明确病原菌种类——致病性强弱体外药敏分析

——治疗的依据细菌检验的现状检测时间过长（TAT）阳性检出率低（假阴性）假阳性率较高（污染/定植）无法同步检出（细菌/病毒）细菌检验现状临床表现WBC及CRP影响因素多诊断价值低血培养耗时长检出率低假阳性无特异性2小时-1天2-3天4-6天入院采血WBCCRP普通培养鉴定药敏血培养二、多重基因检测系统多重基因扩增的原理a.

靶向扩增目的基因多重基因扩增的原理b．通用引物等比例扩增所有目的基因多重基因扩增的原理c．毛细管电泳分离检测不同长度片段扩增产物多重基因扩增的优化因素优化方案1)多种软件设计含有特异和通用序列的引物保证基因扩增的特异性和等效性产物扩增效率反应条件优化2)将所有产物的片段大小锁定在150bp-300bp之间1)利用梯度PCR仪对退火温度进行优化2)对体系的盐离子、镁离子、dNTP以及引物等浓度和比例进行优化样本质量质控反应体系质控准

确

性规

范

性用标准Hp菌株作对检测样本质量对照设立基因组DNA、RNA、体系以及空白对照用已知浓度的标准质粒做浓度标准曲线PCR和结果分析等所有环节规范抽提、技术创新点检测方法

通量

耗时(小时)

费用(元)

精准性

灵敏性培养法免疫学PCR11低1200

中等高低中等高7251HMGS2080高高尚无类似技术用于感染性腹泻病原体的高通量精准鉴定操作简便、结果自动判读、流程易于规范化，可广泛应用于上海各级医疗机构！研究目的建立高通量多重基因精准鉴定系统比较评价多重基因检测系统的性能多重基因检测系统的流程的规范化为临床诊疗提供精准的病原学依据三、幽门螺杆菌检测H.

pylori

感染重要性

幽门螺杆菌（

H.

pylori）是一种临床常见的病原菌，与慢性获得性胃炎、消化性溃疡、胃癌等密切相关，为I类致癌因子（WHO/IARC）。

H.

pylori

感染率高，全球超过50%，我国高达40%-80%。

早期发现、早期诊断、早期干预可以有效控制胃癌等疾病发生与发展。H.

pylori诊断现状传统PCR培养法巢式PCR快速尿素酶法分子诊断法传统方法组织切片染色法杂交抗体抗原法？目前方法：检出率低、敏感性低、耗时长，不能同时做药敏和毒力分析等。迫切需要研发一种快速、准确、同时进行鉴定、定量、药敏和毒力检测的新方法！研究方法——引物的设计与合成常见H.pylori菌种与耐药基因多重检测的靶点和意义内

容靶点名称意

义鉴定基因16SrRNA鉴定细菌明确临床诊断和感染剂量定量基因耐药基因ureC克拉霉素耐药——23S

rRNA甲硝唑耐药——rdxA明确Hp耐药性、指导临床用药喹诺酮耐药——gyrA阿莫西林耐药——pbp1AcagA,vacA

s1,vacA

s2,vacA

m1,vacA

m2,iceA1,

iceA2,luxS,

dupA,oipA明确患者感染毒力型和临床致病相关性毒力基因研究方法——临床样本检测与方法学比对1000例临床样本快速尿素酶检测法细菌培养药敏试验HMGS基因检测核酸扩增基因测序组织病理学的检测流

程

图设计多对Hp引物鉴定的特异性引物设计4组Hp耐药基因特异性引物验证Hp菌种、耐药基因的特异性引物，优化Hp多重基因分析系统收集1000例样本，

-80C保存分离培养细菌Hp多重鉴定用Hp培养法、组织染色法13C尿素呼气实验比对系统直接对样本进行菌株耐药Hp多重基因鉴定系统对临床分离菌株样本进行菌株、耐药和毒力检测细菌鉴定体外药敏毒力检测和毒力检测比对、分析上述方法特异性和敏感性，优化Hp多重基因鉴定系统对采集、检测等步骤标准化，行成规范化的检测方案作为Hp检测的规范化方法临床推广应用H.pylori

多重基因检测引物序列Prim

erSequence

(5'-3')Size

(bp)F:

A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

TAA

TTA

CTGA

A

GCTGATTGCG

CR:

G

TACG

ACTCA

CTATAG

G

GACTG

G

AGA

GA

CTAAG

CCCTCCF:

A

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ACA

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A

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G

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CA

A

CCCT

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A

AG

AR:

G

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G

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A

AA

G

ATTTCTTCA

A

TCG

CTF:

A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

TAG

A

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G

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A

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G

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A

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ACA

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A

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A

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CG

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ACR:

G

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G

GAATGG

A

AW

TACA

ACA

A

A

CA

CA

CCF:

A

GGTG

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TAGA

A

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A

ACR:

G

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ACA

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CCF:

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A

TAG

TTTAG

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CY

A

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GTCA

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G

TACG

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G

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A

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GCTATA

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A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

TATTGCTTG

A

TGGCCTG

CA

TTR:

G

TACG

ACTCA

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G

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A

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TG

GA

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GTA

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G

AF:

A

GGTG

ACA

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TAGA

A

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GGA

A

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CA

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AR:

G

TACG

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G

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YTCTG

A

AAA

CA

CTCAF:

A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

TAA

CTTTACCCTTTG

ATG

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GTTA

CR:

G

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G

GATG

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A

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TCG

TTAATG

G

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A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

TAG

TGG

GG

TA

DA

TA

A

TCA

CTTG

AG

AR:

G

TACG

ACTCA

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G

GAACCTA

TA

TCG

CTA

ACG

CA

CTF:

A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

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CA

A

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G

AA

G

ATR:

G

TACG

ACTCA

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G

GAATTATAG

G

GTTTA

GG

CA

CTCTCTTF:

A

GGTG

ACA

CTA

TAGA

A

TAA

CA

CCA

AA

G

TCA

A

AG

CCCCTR:

G

TACG

ACTCA

CTATAG

G

GACCCA

TA

GG

CG

A

CCA

A

TCCA

Y16S

rRNAureC147Gene

ofIdentification138210cagAvacA

s1vacA

s2vacA

m1vacA

m2iceA1299327282166Gene

of

V

irulence234iceA2171/277187dupAoipA317luxS242PrimerSNPSequence

(5'-3')Size

(bp)F:

AGGTGACACTATAGAATAGGTGGTATCTCAAGGATGGCR:

GTACGACTCACTATAGGGAAACCGCGGCAAGACGGGAR:

GTACGACTCACTATAGGGAGATCTAACCGCGGCAAGACGGCGF:

AGGTGACACTATAGAATACACTCTAACYTTATAAGACTCYGGRTAR:

GTACGACTCACTATAGGGACGCCAAGCTCTTACAACACCCR:

GTACGACTCACTATAGGGAACTATCGCCAAGCTCTTACAACACTTF:

AGGTGACACTATAGAATATTTGGGGACATCAAACTTTCTTR:

GTACGACTCACTATAGGGACGACYATTRGCAAAGGAGCAAR:

GTACGACTCACTATAGGGATAACACGACYATTRGCAAAGGAGCTGF:

AGGTGACACTATAGAATAAAGGTTAGGCAGACGGCTR:

GTACGACTCACTATAGGGACACCCCCATGGCGATATYR:

GTACGACTCACTATAGGGATTAACCACCCCCATGGCGATAGR23SrRNArdxAAG175180CT253258GeneofRisistancepbp1AgyrAAG154159C/T306311G/AHMGS中单重基因引物的验证HMGS中单重基因引物的验证HMGS多重基因扩增系统的优化优化前优化后Size(nt)Size(nt)HMGS的特异性HMGS对H.pylori鉴定、毒力和耐药基因的检测HMGS对H.

pylori耐药基因混合感染的相对定量分析HMGS对H.pylori耐药基因的混合感染相对定量10y=1.1677x

-0.3524R²=0.9781864200246810template

ratio-2克拉霉素23SrRNA

(23S

rRNA_G)and

(23S

rRNA_A)小

结建立了HMGS多重基因检测系统HMGS具有高度特异性和灵敏性HMGS可有效检测所有目标基因123研究方法——临床样本采集与处理入选标准排除标准消化不良症状的患者年龄在18-65岁男女不限中华医学会消化分会：临床表现为上腹部疼痛或烧灼感、餐后上腹饱胀症候群,可伴食欲不振、嗳气、恶心或呕吐等症状，胃镜检查及胃黏膜活检。

内镜证实有活动性出血

已接受过Hp根除治疗

最近1个月曾经服用铋剂、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂、抗生素

所用的药物有过敏史或皮试阳性患者

孕期及哺乳期患者H.pylori分离培养结果26.0%248955胃组织活检标本H.pylori培养阳性率分析GroupsChronicgastritisPepticulcerGastriccancerMalesPositiveNo.

NegetiveNo.

Positive

Percentage171716158321.8%46.1%20.0%28.8%23.0%25.4%32.7%24.2%17.6%DiseasesGender141261171531139144Females19-2930-498116740289Age50-6912819≥70P<0.0560402006040P<0.0124.6%P<0.05604045.8%P<0.0532.7%29.3%23.1%25.4%25.0%22.1%17.6%20020032•

发现阳性培养率与性别、年龄和疾病类型相关H.pylori体外药敏试验MIC(µg/ml)AntibioticsResistanceSensitiveMICMIC9050ClarithromycinMetronidazoleAmoxicillin1.51.50.0320.2564960.25819(14.4%)

113(85.6%)84(63.6%)

48(36.4%)0(0.0%)

132(100.0%)40(30.3%)

92(69.7%)LevofloxacinH.pylori体外药敏实验结果ResistanceMIC

(µg/ml)MIC

MICPatterns

of

multipleresistanceNo.

ofstrainsrate(%)5090Sensitive

to

all

antibioticsCLA37347028.02.335.60.01.564960.258SingleresistanceMTZAMX1.50.0320.25LEV53.8MTZ+CLA53.818.22.3DoubleresistanceCLA+LEV38TripleresistanceMTZ+CLA+LEV6.1•

共发现55例单重耐药菌株，32例双重耐药菌株，8例三重耐药菌株；•

多重耐药率为30.3%。H.pylori

耐药基因突变测序结果23S

rRNA-A2143GrdxA-C148Tpbp1A-A1777GgyrA-C261G35H.pylori

耐药基因突变情况DNA

sequecinganalysisResistanceSusceptibilityAntibioticsχ2P

valueGeneMutations(Na

,%)18(94.7)2(10.5)15(78.9)6(7.1)47(56.0)33(39.3)0(0.0)(nb

,%)6(5.3)0(0.0)97(85.8)0(0.0)30(62.5)20(41.7)4(3.0)87.440(

P

=0.000)12.078(

P

=0.000)0.601(

P

=0.438)3.592(

P

=0.058)0.539(

P

=0.463)0.072(

P

=0.788)-CLA23SrRNAA2142GT2182CMTZrdxAT184GG616AC1667GA1684GAMXpbp1A0(0.0)2(1.5)-0(0.0)9(6.8)-7(17.5)7(17.5)7(17.5)2(5.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)17.002(

P

=0.000)17.002(

P

=0.000)17.002(

P

=0.000)4.671(

P

=0.031)17.002(

P

=0.000)LEVgyrAG271AG271TA272G7(17.5)0(0.0)Na

:H.

pylori对CLA、MTZ、AMX与LEV耐药的菌株总数分别为19、84、0与40nb

:H.

pylori对CLA、MTZ、AMX与LEV敏感的菌株总数分别为113、48、132与92HMGS对H.

pylori临床分离株耐药基因的检测HMGSConcordancerate(%)Performanceof

HMGS

assayGeneSequencingAC1WTMTSensitivitySpecificity2143_A2143_G148_C1070126012001090223063991423SrRNArdxA98.41000.98171.00000.97560.9237148_T1777_A1777_G261_C/T261_G/Apbp1AgyrA97.793.2根据Landis

&Koch原则，以下标准用于一阶一致性系数Gwet’s

AC1对一致性的判断：<.0：弱；.00

-0.20：较弱；0.21-

0.40：一般；0.41-

0.60：中等；0.61-

0.80：较强；0.81-1：强。H.pylori药敏情况与临床特征相关性分析NumberofSingleresistancerate(%)Multipledrugresistancerate(%)GroupsH.pylori

strainsCLAMTZLEVCLA+MTZ

MTZ+LEV

CLA+LEV

CLA+MTZ+LEVCSG185.611.15.616.60.05.6DiseasesGenderCAGPUD75397062104068140.05.14.30.010.05.00.00.04.00.04.33.20.07.51.57.12.75.12.94.80.07.52.90.020.015.414.322.620.010.022.121.44.00.00.04.80.02.52.90.09.30.04.38.110.05.0MalesFemales19-2930-4950-69≥7042.929.050.035.041.27.1Age2.921.4•

消化性溃疡患者H.

pylori的单重MTZ耐药率显著高于慢性胃炎患者（χ2=8.786，P=0.012）H.Pylori

毒力基因与疾病类型相关性•

iceA1+/iceA2+混合基因型降低了胃黏膜萎缩的发生；•

消化性溃疡的危险度随vacA

s1m2基因型的出现而增大，而vacAs1m1基因型则是慢性胃炎的相对危险因素；•

iceA2及iceA1+/iceA2+混合基因型是消化性溃疡的危险因素。dupA+

H.

pylori菌株的感染显著增加了十二指肠溃疡的危险度（OR:

3.186;

95%CI:

1.068-9.503）HMGS可以有效检测胃活检样本中H.

pylori感染20000016s

rRNAureCβ-globin8000070000600005000040000300002000010000betaglob175000Beta-globin16S

rRNAluxS15000012500010000075000ureCbetaglob23S_AoipAdupAcagAvacA

s1rdxA_CgyrA

_C/vacA

m2500002500000100150200250300350400100150200250300350H.pylori感染阳性H.pylori感染阴性HMGS可在胃活检样本中有效检测所有目标基因A.B.1750001500001250001000007500050000250000β-globincagAβ-globinoipAvacAs1oipAvacAm21500001250001000007500050000250000betaglobvacAs1gyrA_C/pbp1A_A16S

rRNAureCluxScagArdxA_C23S_AbetaglobluxSvacAm2iceA2iceA2luxSluxS16S

rRNAureC23S_ArdxA_CiceA1iceA2vacAm1pbp1A_AiceA1oipAvacAm2vacAm1vacAs1oipAvacAs1iceA2vacAm223S_GcagAgyrA_C/pbp1A_GdupApAdudupArdxA_TcagAgyA_A/GdupA100150200250300350100150200250300350HMGS对胃活检样本直接检测的方法学评价Gene

SequencingSensitivity

SpecificityPPVNPVAccuracyMethodsPositive40NegativeTotal40%%%%%PositiveNegativeTotal0Culture30636369357.1100.0100.090.367.780.377.485.07013362PositiveNegativeTotal56RU090.57013372PositiveNegativeTotal68HMGS259636170133注：在基因测序和多重基因检测中，菌种特异性基因16S

rRNA和ureC同时阳性判断为幽门螺杆菌感染。•

HMGS在对H.

pylori的诊断上优于培养法和RUT法，准确性与基因测序方法相近。HMGS对胃活检样本及其对应菌株中H.

pylori的检测BiopsyAntibioticsCLAGeneIsolatesWT270MT1Mixed2143_A2143_G2323SrRNA7148_C148_T3710101MTZAMXLEVrdxApbp1AgyrA1777_A1777_G2511571261_C/T261_G/A3000622HMGS可区分胃活检样本中H.

pylori的混合感染A.B.2000002000000

pbp1A_A23SrRNA_GrdxA_CgyrA_C1750001750000pbp1A_A16S

rRNA

vacAm2β-globinluxSureCureCrdxA_Cbetaglob23S_G150000125000100000luxS1500000pbp1A_GgyrA_C/16SrRNApbp1A_A23SrRNA_GrdxA_C1250000oipAdupA1000000rdxA_CvacAs1pbp1A_Apbp1A_G23S_GcagAcagAgyrA_C75000050007500050000vacAm2oipAgyrA_C/00vacAs1250000250000iceA1iceA100100150200250300350100150200250300350Size(nt)Size(nt)研究小结建立并优化了H.pylori菌种鉴定、毒力及耐药高通量多重基因检测系统（HMGS），能够特异性地对H.

pylori感染进行诊断，并且对临床分离株毒力基因及耐药基因突变位点的检测均与测序结果具有高度的一致性。12H.pylori

毒力基因vacA

s1m2、iceA2基因型是消化性溃疡的的危险因素，单一iceA1基因或iceA2基因的存在加重了慢性萎缩性胃炎的危险度，而dupA+

H.pylori菌株的感染与十二指肠溃疡发生显著相关。上海地区H.pylori对甲硝唑（MTZ）和左氧（LEV）的耐药均处于较高水平；多重耐药率呈上升趋势，对克拉霉素（CLA）、MTZ、LEV的耐药分别与23SrRNA、rdxA、gyrA和pbp1A相应位点的突变相关。34HMGS能够对胃黏膜组织中H.

pylori的混合感染进行检测。四、腹泻病原体检测感染性腹泻的重要性

腹泻疾病居所有肠道疾病之首，其中感染性腹泻占>70%，是第二大感染性疾病。

全球每年患病20亿人次，我国每年发病高达8.4亿人次，造成医疗费用等直接经济损失约数百亿元/年。

病因不明和反复治疗无效的慢性和迁延性腹泻显著增加，给患者带来极大痛苦，为医院和社会增加沉重负担。Centers

for

Disease

Control

and

Prevention,

2014WHO,

2015感染性腹泻的检测流程

腹泻病原体种类多达数十种，主要包括沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、弧菌、轮状病毒和腺病毒等。沙门菌/志贺菌（SS平板）弧菌（TCBS平板）++生化鉴定血清鉴定药敏试验采集粪便样本-致病大肠菌（麦康凯平板）空肠弯曲菌（空弯平板）艰难梭菌（CCFA平板）血清鉴定药敏试验-免疫学检测核酸检测大肠杆菌沙门氏菌轮状病毒腹泻性肠炎感染性腹泻的治疗现状缺乏精准的病原学诊断经验性治疗临床疗效差耐药株增加

肠道菌群失调Nature

Reviews

Gastroenterology

andHepatology,

2014NEngl

JMed,

2014感染性腹泻相关精准诊疗的指南和政策世界胃肠学组织全球指南—：全球观点（2012）成人急性感染性腹泻诊疗专家共识（2013）只要有可能：在严重血性炎症性腹泻或感染性腹泻诊断包括临床诊断和病原学诊断，后者为流行病学调查以及预防和控制腹泻病的传播和流行提供重要线索！持续性腹泻患者都要进行粪便分析《国家卫计委2015年抗菌药物临床应用指导原则》明确指出：抗菌药物的应用必须根据明确诊断后可应用！常规检测方法无法满足病因学诊断的需求！基因检测技术在精准医学的应用2015年1月：奥巴马提出“精准医学战略”2015年3月：科技部/卫计委启动“中国精准医学战略”2015年6月：国家发改委

（发改高技[2015]1303号）大力推动基因检测等新型技术在精准医学的应用！建立了快速、准确、低成本的基因精准检测新技术，可以在一个反应体系同步检测数十种目的基因DP-HMGS建立病原体基因序列病原体基因序列鼠伤寒沙门菌猪霍乱沙门菌副溶血弧菌拟态弧菌M86634.1;

(opdA):

M84574.1NC_006855.1;(fimH):

KJ095887.1NZ_LIRR01000034.1;(tlh):AY578148.1KC182593.1;(toxR):

EF693743.1AY585348.1;

(icsA):

AF336778.1AE014073.1;

(ipaH):

M76444.1肠致病型大肠埃希菌肠出血型大肠埃希菌NZ_LGBM01000011.1;(eaeA):U38618.1U12572.1;(stx1A):AY135685.1痢疾志贺菌福氏志贺菌鲍氏志贺菌宋内志贺菌NZ_CP011511.1;

(recA):DQ995254.1肠侵袭型大肠埃希菌

AB154407.1;(ipaH):JQ638638.1KF494347.1;(lt):JX867103.1肠产毒型大肠埃希菌肠黏附型大肠埃希菌NZ_CP011423.1;(ipaB):HQ591459.1DD286758.1;

(aggR):Z32523.1小肠结肠炎耶尔森菌NC

003912;

NC

008787;NC

009707;

NC

009839GU345828.1;(Yst):

X65999.1空肠弯曲菌NC_017174.1;A:

NC_001460.1

B:

NC_011203.1C:

NC_001405.1

D:

NC_010956.1E:

NC_003266.2

F:

NC_001454.1艰难梭菌(tcdA):

JQ809335.1(tcdB):

KC292195.1腺病毒诺沃克病毒人星状病毒NC_001959.2NC_001943.1轮状病毒NC_011507.2临床检测600例临床样本粪便样本抗原检测粪便样本细菌培养腹泻病原体鉴定系统粪便样本核酸检测血液样本抗体检测技术路线确定上海地区最高发的腹泻病原体优化多重包括病原体特异序列、简并序列、通用序列、内参和质控对照的基因鉴定系统收集600例粪便样本多重基因鉴定系统培养鉴定（细菌）抗原检测

抗体检测

核苷酸检测（病毒）

（病毒）

（病毒）规范整个检测流程相关环节，形成规范化诊断方案临床验证和应用HMGS引物序列PrimerPathogens中文名称Primer

sequence

(5'-3')Size

(bp)F:

GTCCTTCTTTTAAATCATAAAATCTATGR:ACAAGATACTTTTGCTCAAGTTAATCF:

GTCTTCCTCTGTGGAACACATATAR:AGAGATTGCAGTGTCGTTTTTAGF:

GTAGCTGAGTCTGAAGGAGCATTR:TATATGTTATTGATGGTGATGAAAAGAF:

TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGR:GCTCGCTGCACAAAAGCGC.jejuni空肠弯曲菌志贺氏菌209bpShigellaC.difficileS.enteritidisS.typhimuriumETEC136bp202bp120bp113bp190bp152bp251bp292bp129bp196bp165bp218bp159bp226bp145bp308bp308bp308bp106bp233bp313bp艰难梭菌肠炎沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌肠产毒型大肠埃希菌肠出血型大肠埃希菌肠致病型大肠埃希菌肠粘附型大肠埃希菌肠侵袭型大肠埃希菌弧菌F:

GCGTCTTCAGCGACCAGTTCR:ATCTTAAGCTACATCATCGGCTGF:

GGATTACATCGTAACAGGGAATATAGAR:CAATTACAGGTGATACTTGTAATGF:

GACATCGGTGTCTGTTATTAACCR:TTGCCGTATTAACGAACCCGGF:

GGCGATTACGCGAAAGATBacteriaEHECEPECR:AGGAACAAACGCTGGCCAGF:

GACACAAAAGAAGGAAGCAATACR:TTGAATCATCATTATGATCGATACTCF:

GCAGGGAAATGTTCCGCCR:AGAGCTGAAGTTTCTCTGF:

ACATCACCCATGACGGTGATEAECEIECVibrioR:GGGCTGAAAGTGGCATCGACF:

GACCTGAAGTACCGTTATGAACTCGATGATAR:CATATTCGTTRATGCGGAAAGATGGF:

GCTCTGCGGTCCTAGTTAGAATTGR:TTGGCATGACGTTATAGGCTACAAF:

TAGRAGACAGCCCGGACR:GTGCCRCTGGTGTTTGAF:

GACCCCTGGATTAGAACAAATTTR:CGGCGGCGAAGAGGATCTTY.enterocoliticaE.coli-O157HASV小肠结肠耶尔森氏菌大肠埃希菌O157型人星状病毒NorV诺如病毒F:

CAACATCGGCACCCCTCTHADV人肠道腺病毒轮状病毒AR:GGACCAAGATTGATTATTAACTTAGAGF:

GAGGGTTTGARACTGATAGAGAR:CTTATTYTTTGAAAAAAGTAGCTGTTCF:

CTCTCACATATGGAGTATTAGCTGAR:GGATGCAACRCCATGATATCTTATTATTTF:

TGTCAAGCTATGATGTTCACAATTTCTR:GGTGATGAYACTAATTTYGCTAATGATF:

GATGAGTATGCCTGCCGTGVirusRoVARoVB轮状病毒BRoVC轮状病毒CHu-RNAHu-DNAIC人RNA内参R:ATGCGGCATCTTCAAACCTF:

GTGGATGCTACTTGTCCAATGATGR:ACAATTCTCCGATCCGTCCCTAACF:

GTGGCCGCTTTTCTGGATTCATR:TGAAGGCACAGTCGAGGCTGControls人DNA内参外控HMGS引物验证结果利用病原体标准菌/毒株多引物单模板，扩增出各病原体的特异片段(A)(B)10069001401401401801801802202602602603001006300420021000140180220220220260260260300300300C.

jejuniICShigella460023000IC(C)(D)10022030010014014018012000800040000C.difficile1500010000ICHASVIC50000(F)(E)1002203001001803300220011000NorVIC240001600080000ETECIC(G)(H)1001401802202603001001401802202603003300220011000EHEC240001600080000ICICEPECHMGS引物验证结果(I)(J)100140180220260300100140180180220220260260300IC6900IC12000EIEC4600800040000EAEC23000(K)(L)10014018022026030010014030012000800040000ICRoV12000800040000S.enteritidisIC(M)(N)10015000100001401801802202603001001401802202202602603003009000600030000S.typhimuriumVibrio50000ICIC(O)(P)1001402202603001001401803900260012000800040000Y.enterocoliticaHADVICIC13000(Q)100140180220260300150001000050000每个反应只出现特异信号，无交叉反应E.coli-O157ICHMGS优化结果优化前：目的基因峰高参差不齐，有的检测不出100140180220260300ETEC21000180001500012000HASV9000

Hu_RNA.typhimuriumVibrioC.difficileEPECShigellaEHECHADVRoV600030000Hu_DNANorVICenteritidisEIECEAECJejuni优化后：所有目的基因都出现，并且峰高较均匀100140180220260300HASV1500012000E.

coli-O157Hu_RNAS.typhimurium90006000Hu_DNAEPECShigella

EHECEAECVibrioC.difficileS.enteritidisEIECY.EnterocoliticaETECRoV

ICHADV30000C.

JejuniNorVHMGS特异性验证结果阳性对照出现所有病原体特异峰，阴性对照病原体中无特异性信号峰出现100140180220260300(A)HASV15000

Hu_RNAE.

coli-O157S.typhimurium1000050000Shigella

EHECHu_DNAC.difficileEPECenteritidisEIECEAECHADVY.EnterocoliticaETECRoVICVibrioNorVC.

Jejuni(B)(C)100140180180220220260260300100140180180220260300IC1500100050002100H.pyloriICE.coli-DH5a14007000(E)(D)100140300100140220260300150010005000240016008000P.

aeruginosaICS.

aureusICIC(F)(G)100140180220220260260300100140180180220220260260300300180012006000180012006000PlesiomonasshigelloidesICSapovirus(H)(I)10014018030010014012008004000210014007000E.

coliICH2OICHMGS内参和质控评价结果内参和质控出现证明从粪便核酸抽提过程、PCR、毛细管电泳分离过程准确可靠(A)100140180220260300Hu_DNA180001200060000C.difficileICHu_RNA(B)100100100140180220260300人基因组内参RNA人基因组内参DNA质控内参180001200060000Hu_DNHu_RNAIC(C)140180220260300IC12000800040000(D)150200250300240001600080000HMGS单重灵敏度利用克隆质粒标准品对各病原体的灵敏度如下PrimerPathogensSensitivity(copies)10010C.jejuniShigella1000100010001000100C.difficileS.

enteritidisS.

typhimuriumETECBacteriaEHECEPEC1001000100EAECEIEC10001000100VibrioY.enterocoliticaE.coli-O157HASV100NorV10VirusHADV101000RoVHMGS多重灵敏度以10倍体积稀释混合病原体质粒进行多重灵敏度检测，检测下限为1×

103copy/μL(A)1×105copy/μL10014018022026026026030030030015000100005000HASVHu_RNAtyphimuriumE.

coli-O157Hu_DNAC.difficileVibrioETECShigella

EHECEPECEAEC.enteritidisEIECHADVY.EnterocoliticaRoV

ICC.

Jejuni

NorV0(B)

1×104copy/μL100140180220HASV3900ICHu_RNAE.

coli-O1572600S.typhimuriumShigellaHu_DNAC.difficileVibrioEPECEAEC.enteritidisEIECHADV1300EHECY.EnterocoliticaRoVETECC.

JejuniNorV0(C)

1×103copy/μL100140180220E.

coli-u_RNAC.difficileJejuniS.typhimuriumICShigellaHASVY.EnterocoliticaETECHu_DNANorV8000.enteritidisEIECHADVEHECVibEPECEAECRoV(D)ddH2O100140180220260300180001200060000HMGS干扰试验结果单模板出现的峰高与混合模板中对应峰高相似，说明HMGS检测混合感染病原体间的干扰较小(A)肠炎沙门氏菌、人肠道腺病毒、肠出血型大肠埃希菌100140HADV180220260300180001200060000EHECS.enteritidisS.enteritidisICIC(B)

肠炎沙门氏菌1001401802202603003900260013000(C)人肠道腺病毒100140HADV180220260300210001400070000IC(D)肠出血型大肠埃希菌1001401802202603006300420021000EHECICHMGS混合感染准确性验证结果HMGS检测出混合模版中所有的信号峰，无其他杂峰，证明HMGS对混合感染检测的准确性良好(A)肠炎沙门氏菌、肠出血型大肠埃希菌100140180220260300180001200060000EHECICS.enteritidis(B)肠炎沙门氏菌、肠出血型大肠埃希菌、其他肠道病原体100140180220260300240001600080000EHECS.enteritidisIC(C)肠炎沙门氏菌、人腺病毒、肠出血型大肠埃希菌1001401802202603002100014000HADVEHEC70000S.enteritidisIC(D)肠炎沙门氏菌、人腺病毒、肠出血型大肠埃希菌、其他肠道病原体100140180220260300240001600080000HADVEHECS.enteritidisICHMGS临床样本检测结果利用已知感染病原体的临床粪便样本对HMGS体系进行验证(A)艰难梭菌样本100140180220260300Hu_DNA18000120006000C.difficileICHu_RNA0(B)轮状病毒样本1001502002503002400016000Hu_RNAICRoV80000Hu_DNA(C)细菌病毒混合感染100140HADV180220260300S.typhimurium27000180009000Hu_DNAC.difficileICHu_RNA0(D)阴性样本10015020025030012000800040000Hu_DNAICHu_RNAHMGS临床样本检测临床样本验证流程图HMGS临床样本检测粪便样本病原体分析鉴定方法和流程HMGS临床样本检测结果常规方法鉴定结果与金标准鉴定结果对比显示培养鉴定灵敏度低SequencingBacteriaVibrioCultureSensitivity0.5750.4150.3330.3330.2140.2670.0000.3250.3790.2960.2500.0000.167Specificity1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000PPV1.0001.0001.0001.0001.0001.000/NPV

Accuracy+231717242-0573057206070+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-0.9710.9600.9930.9900.9640.9460.9980.8190.9700.9690.9900.9930.9920.9720.9610.9930.9900.9640.9470.9980.8340.9710.9690.9900.9930.992S.

typhimuriumS.

enteritisShigellaC.difficileC.jejuniY.

enterocoliticaEPEC4366040622123305850578061204620149102111881.0001.0001.0001.000/ETEC5840EAEC192586060506090607EIEC60EHEC4+-1E.coliO157Virus1.0005real-time

PCR+-+-+-31055080258035551604Norovirus1.0001.0001.0000.9970.9950.9980.9390.9480.8881.0001.0001.0000.9970.9950.995RotavirusAdenovirusHMGS临床样本检测结果DP-HMGS鉴定结果与金标准鉴定结果对比SequencingPathogensVibrioHMGSSensitivity0.9751.0000.6671.0001.0000.9781.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000Specificity0.9980.9980.9970.9981.0001.0001.0001.0000.9971.0000.9981.0000.9970.9880.9960.9951.000PPV0.9750.9760.6670.9001.0001.0001.0001.0000.9351.0000.8891.0000.7500.8160.9640.7501.000NPV

Accuracy+391-1+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-0.9981.0000.9971.0001.0000.9981.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9970.9980.9930.9981.0000.9981.0001.0000.9971.0000.9981.0000.9970.9820.9900.9930.997572157126051603058505680612046225820586160406092605757525563410S.typhimuriumS.enteritisShigella4290280C.difficileC.jejuni441101510290Y.

enterocoliticaEPECETEC270EAEC8EIEC04EHEC06E.coli

O157NorovirusRotavirusAdenovirusAstrovirus031055090+-+60104HMGS临床样本检测结果DP-HMGS与常规方法检测结果的对比分析HMGS临床样本检测结果DP-HMGS检测结果发现各种病原体在不同年龄性别分布不同Pathogens

PositiveAge(n[%])Gender(n[%])numbers(n[%])0-19(n=117)20-39(n=213)40-59(n=134)60-79(n=138)≥80(n=11)P

valueMale(n=319)Female(n=294)P

value(n=613)BacteriaVibrio401

(65.4)

41

(35.0)170

(79.8)18(8.5)92

(68.7)13(9.7)8(6.0)91(65.9)7(5.1)7

(63.6)1(9.1)0.0000.0110.001215

(67.4)24(7.5)186(63.3)16(5.4)0.2820.2970.71440(6.5)1(0.9)0(0.0)S.

typhimurium

42(6.9)S.

enteritidis

6(1.0)19(8.9)14(10.1)1(9.1)23(7.2)19(6.5)1(0.9)3(1.4)2(1.5)3(2.2)6(4.5)12(9.0)0(0)0(0.0)1(0.7)3(2.2)4(2.9)0(0)0(0.0)1(9.1)0(0.0)0(0.0)0(0)0.6360.2660.0420.0601.0000.0200.0140.7940.2350.3110.8830.0000.4260.0000.0190.3770.0002(0.6)4(1.4)0.3570.0090.3470.5520.3370.2280.9610.2450.0170.6251.0000.7110.9400.7100.0791.0000.320Shigella10(1.6)28(4.6)44(7.2)1(0.9)4(1.9)1(0.3)9(3.1)C.difficileC.jejuni12(10.3)6(5.1)7(3.3)17(5.3)21(6.6)1(0.3)11(3.7)23(7.8)0(0)22(10.3)1(0.5)Y.enterocolitic

1(0.2)0(0)EPEC151(24.6)13(11.1)0(0)64(30.0)13(6.1)10(4.7)3(1.4)31(23.1)7(7.5)6(4.5)3(2.2)0(0)41(29.7)10(7.2)8(5.8)1(0.7)0(0)2(18.2)1(9.1)0(0.0)1(9.1)0(0)85(26.6)16(5.0)17(5.3)1(0.3)66(22.4)15(5.1)10(3.4)8(2.7)ETEC31(5.1)27(4.4)9(1.5)EAEC3(2.6)EIEC1(0.9)EHEC4(0.7)2(1.7)2(0.9)3(0.9)1(0.3)E.coliO157Virus8(1.3)1(0.9)4(1.9)1(0.7)17(12.7)9(6.7)5(3.7)2(1.5)1(0.7)109(81.3)2(1.4)8(5.8)5(3.6)3(2.2)0(0)0(0)4(1.3)4(1.4)111(18.1)38(6.2)57(9.3)12(2.0)4(0.7)63(53.8)6(5.1)22(10.3)17(8.0)1(0.5)1(9.1)1(9.1)0(0)56(17.6)20(6.3)31(9.7)3(0.9)55(18.7)18(6.1)26(8.8)9(3.1)NorovirusRotavirusAdenovirusAstrovirusTotal48(41.0)7(6.0)3(1.4)0(0)2(1.7)1(0.5)0(0)0(0)2(0.6)2(0.7)512(83.5)104(88.9)192(90.1)99(71.7)8(72.7)271(85.0)241(82.0)HMGS临床样本检测结果DP-HMGS检测结果发现各种病原体在不同年龄分布不同HMGS临床样本检测结果急性感染性腹泻患者多重感染严峻HMGS临床样本检测结果常见腹泻病原体多重感染的组成及比例CombinationPercentage%(n=107)EPEC

+

Vibrio12.1%10.3%10.3%9.3%4.7%4.7%3.7%2.8%2.8%1.9%2.8%1.9%1.9%1.9%1.9%EPEC

+

EAECEPEC

+

S.

typhimuriumEPEC

+

C.

jejuniEPEC

+

ETECC.

difficile

+

RotavirusC.

jejuni

+

C.

difficileEPEC

+

RotavirusEPEC

+

ETEC

+

EAECEPEC

+

EAEC

+

S.

typhimuriumEPEC

+

E.

coli

O157EPEC

+

Norovirus

+

VibrioEPEC

+

S.

typhimurium

+

VibrioS.

typhimurium

+

C.

jejuniETEC+EAEC小

结建立了HMGS多重基因检测系统HMGS具有高度特异性和灵敏性12