武汉大学遗传学课件 第6章真核生物重组的分子机制

6.3真核生物重组的分子机制6.3.1同源重组发生在减数分裂前期

重组(recombination)是已经存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组;无论是分子内还是染色体内重组都是酶依赖的过程，新的遗传物质通过DNA的剪切和连接产生。

同源重组（

homologous

recombination）又称普遍性重组（

generalized

recombination）

，它的发生是依赖于较大范围的DNA同源序列的联会。

Homologous

recombination

involves

a

reciprocal

exchange

of

sequences

of

DNA,

e.g.

between

two

chromosomes

that

carry

the

same

genetic

loci.

重组对之间需要有同源性。调节这一过程的蛋白(如大肠杆菌中的RecA)不是序列专一性的，而是同源依赖的。经常涉及长的同源区域(如减数分裂中)。

真核生物的遗传重组发生在减数分裂时期的同源染色体的非姊妹染色单体之间，而且染色体或DNA

分子之间相互交换对等的部分。重组热点:即某类序列发生重组的概率高于其他序列。真核生物的染色质状态影响重组，如异染色质及其附近区域很少发生重组。同源重组对同源区的长度要求：大肠杆菌活体重组至少要求20～

40

bp同源序列哺乳动物基因间的重组要求同源序列在150

bp以上。同源区越长越有利于同源重组。在真核生物中，双链DNA分子间基因重组是完成减数分裂所必需的，而且基因重组发生在减数分裂前期（图6

－12）

（1）

Holliday

模型（霍利迪模型）

狭义的遗传重组专指因为DNA分子内断裂—接合而引起基因交流的过程。

同源重组有时又叫交换（crossing

over）

它发生在DNA同源序列之间。

1964年，R.Holliday设想了一个模式，用来解释同源重组，经过许多细节上的修改：Holliday

model

for

reciprocal

genetic

recombination图五6.3.2同源重组的分子模型1、同源染色体的识别和配对排列2、两条多核苷酸链在对应位置断裂并相互侵入（交换）3、酶的作用使交换的链连接形成Holliday中间体4、分枝移位（Branch

migration）形成异源双链DNA（Heteroduplex

DNA）5、异源双链DNA转动，再次拉长Holliday中间体6、由内切酶在水平方向或垂直方向切开Holliday中间体7、产生带间隙的双螺旋8、酶的作用使隙连接起来图五(2)、Meselson-Radding

模型（单链侵入模型）

单链侵入模型。在两个DNA分子中的一个单链发生断裂，游离出一个单链末端侵人到另一个DNA分子中。被切割的DNA留下的缺口由DNA聚合酶进行修复(虚线)。在另一个DNA分子中被替代的链降解，而两个末端被连接(见箭头)。开始，一个异源双链(用斜线代表)将只在两个DNA分子中的一个形成，支链迁移将在另一个DNA分子上产生另一个异源双链。像在Holliday模型一样，异构化使两侧的DNA分子重组。通过这个模型，异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成。然后一旦Holliday连接体形成，支链迁移能在另一个DNA分子上产生异源双链。这就解释了两个DNA分子中异源双链是如何形成的.双链断裂重组模型（Double-strand

breaks

initiate

recombination）虽然Holliday模型以及随后的Meselson和Radding所作的修改可以解释生物中发生的大多数同源重组事件，但仍有一些例外的重组现象，最典型的例子为基因转换(gene

conversion)。基因转换首先在酵母及真菌中被发现，现已证实在许多生物中存在。酵母中配子融合产生杂合子，后者经减数分裂形成有4个孢子的子囊。假如配子在某一座位有不同的等位基因，正常情况下2个孢子将表现同一基因型，另2个孢子表现另一基因型。但有时会出现例外，即这种2：2的分离比例由3：1比例取代。这种现象被称为基因转换，即一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式，只发生在减数分裂时期。有一种双链断裂模型用于解释重组过程中发生的基因转换事件，它们并非由单链缺口起始，而是先在1个双链分子中产生断裂，即2个单链在同一位置产生缺口,然后将这2个缺口转移到同源的另一双链分子。（图：哺乳动物DNA双链断裂重组机制）6.3.3联会复合体与重组

在减数分裂过程中，同源染色体配对形成联会复合体。多年来，认为联会复合体与重组有关，有可能是DNA

重组的必要前提。而近年研究表明，联会复合体是重组的结果，而不是原因。

（1）

联会复合体在双链断裂后形成

对酵母的研究结果证明，不论是同源重组还是位点专一性重组，只有双链断裂才能起始重组。

双链断裂也发生在减数分裂早期，而且是在联会复合体形成之前

在一种酵母突变（

rad

50）中，由于突变阻止平齐末端转变为单链突出端，导致重组无法进行，可见双链断裂对于重组是必需的前提。

重组与联会复合体的形成关系密切，果蝇和酵母中研究结果表明，凡是不能进行染色体配对的突变体都不能发生重组。由此可见产生双链断裂并进一步引发重组的系统是很保守的。

根据rad

50突变型不能将中央成分转变为联会复合体的现象，认为在减数分裂中，联会复合体是染色体配对所必需的，进而使分子水平引起重组这一传统观点受到了挑战。

在酵母的研究中发现，联会复合体是在双链断裂起始重组之后形成，它一直持续到重组体形成，故联会复合体对于重组的形成不是必需的。而在一些缺失正常联会复合体的突变体中重组型仍可以形成，不能进行重组的突变型则不形成联会复合体。这充分表明：联会复合体仅仅是随染色体配对之后的重组结果。

人们一直认为：Holliday结构的解离方式决定了最终是产生非交换产物还是交换产物，即取决于解离发生在哪些链上。但是最近对于非交换和交换产物生成时间的分析表明，交换产物直到接合分子第一次产生后的相当一段时间才会出现，而非交换产物几乎与接合分子同时出现。如果两种产物由同一解离过程产生，那么它们就应在同一时间出现。这一时间上的差异表明，交换产物不是按原先设想的通过接合分子解离产生的，而是由另一条途径产生。（2）

同源染色体配对与联会复合体的形成

是两个独立的过程

突变可以发生在染色体配对或是联会复合体形成的任一过程，并且彼此互不干涉。Zip2突变型中染色体可以配对，但不能形成联会复合体，所以同源染色体之间的识别不依赖于重组或是联会复合体的形成

。在rad

50突变体中，双链断裂后的5′端与SpoⅡ蛋白相连［图6－15（b）］

。只有SpoⅡ

被移走后，核酸酶才能发挥作用，并证明至少有9种其他蛋白质共同参与双链断裂过程，一组蛋白质将双链断裂端转变为3′羟基突出的单链末端；另一组蛋白质使单链末端侵入同源双链DNA分子。

图6－15（b）迄今还不能完全揭示重组的发生与所观察到的不同结构——重组结与交叉的联系，且在分子水平上阐明其本质。6.4基因转变及其分子机制6.4.1异常分离与基因转变

在四分子分析中已知一对等位基因杂交子代的子囊可形成6种正常分离类型：

AAAAaaaa

或

aaaaAAAA

AAaaAAaa

或

aaAAaaAA

AAaaaaaAA

或

aaAAAAaa

这只是四分子中是否发生重组和纺锤体随机取向而形成，两种孢子的比例相等，即等位基因A:a＝

4:4。

后来发现有些孢子分离比例异常，如

3:

5和6:

2以及异常的4:

4分离

在脉孢菌和粪生粪壳菌（Sodaria

fimicala）等子囊菌中也发现了一些异常分离（abnormal

segregation）现象。

Mitchell

将与维生素B6

合成有关的不同的突变型进行杂交，将两个吡哆醇突变株杂交:＋

pdxp×

pdx＋

取得子一代子囊后，对585个子囊中的孢子依次解剖，进行培养和鉴定。他发现其中4个子囊中有野生型的孢子对出现，可是跟预期的相反，如果这两个基因间发生了重组，重组后应该同时出现的双突变型（

pdx

pdxp）孢子对却没有发现（表6-7）怎样解释这一现象？

不可能是突变，因为它们的频率远比这些基因的正常突变率高得多。分析的方法是灵敏的，如果有双突变的话，就能够检出。M

itchell的上述实验结果用图6

-16来表示。由于重组，出现了完全野生型的孢子对（

＋

，＋

）

，但没有重组的对应产物——

双突变型的孢子对（

pdx

pdxp），结果应如图6

-16所示。然而发生的情况说明尽管pdxp出现异常的3:1分离，但紧密连锁的pdx基因却显示出正常2:2分离。这些反常的情况，好像是一个基因转变为它的等位基因，这种现象称为基因转变（

gene

conversion）。图6-16中，基因pdxp转变为pdxp＋

（或＋

）

，图中以磑表示该基因发生了基因转变。所以双突变型的孢子对没有出现。6.4.2基因转变的类型

基因转变的类型分为：①

染色单体转变（chromatid

conversion）

，即减数分裂的4个产物中有一个产物发生了基因转变，出现

6g＋

:

2g－

或2g＋

:

6g－

类型的子囊。

图6-17（a）②

半染色单体转变（

half-chromatid

conversion）

，即减数分裂的4个产物中，有1个产物的一半或两个产物的各一半出现基因转变，因而形成5:

3或3:

5和异常4:4即3:1:

3:1类型的子囊，基因转变只影响半个染色单体分离显然是发生在减数分裂后的有丝分裂中，所以又称为减数后分离（

postmeioticsegregation）。图6-17（b），（c）6.4.3基因转变的分子机制

由Holliday模型和DSB起始重组模型都已清楚表明在对称的异源双链区存在着不配对碱基（如G-A

，C-T）

，形成两个杂种分子。异源DNA不稳定，细胞内的修复系统能够识别不配对碱基，并以切除修复的方式完成修复过程,杂种分子得到校正。

研究表明基因转变产生的机制是由于DNA的错配修复（Mis-mathch

repair）。具体过程为：图6－z1

1、在减数分裂前期亲本染色体配对

2、链的交换产生两个错配部分

3、经DNA合成过程切除和修复某条单链的某部分

4、产生6：2（3：1）基因转变的m+基因转变是由于

重组和修复所产生结构进行修复,

4个产物恢复正常配对状态,

子校正到＋

（或g）时，修复后出现6一个杂种分子校正为＋，或校正为g时的半

染色单体转变，分离比

为3:

5两个杂种分子均未校正，复制后出现异常的4＋:4g（或3:1:1:3）的分离按原来两个亲本的遗传两个杂种分子都被

囊孢子分离正常＋

:2g（或2＋

:

6g）的异常分离

由于某些不配对碱基切除修复校正的结果与该区发生双交换的效应一致，其实是基因转变的结果，因此出现C

值（并发系数）大于1，这称为负干涉（

negative

interference）

，即一个区域的交换引起邻近区域另一次交换频率的增加的现象。

大量实验结果表明，大约有一半的子囊发生基因转变的同时伴随两侧遗传标记的重组，而“负干涉”形成的原因显然是基因转变的同时并不伴随两侧遗传标记的重组。

基因转变不仅是专一的，而且是有方向的，它不仅涉及单个位点（或基因座）

，而且涉及染色体的一个区段，如一对含有两个基因差异的突变型杂交时，在某些子囊中可以发生几个基因同时发生转变的现象，称为共转变（

coconversion）

。共转变的频率大于独立转变的预期频率，两个基因距离越近，共转变频率越大，即在异源双链的同一区域内沿相同方向同时被修复校正的概率越大。基因转变的极化子模型（

polaron

model

）：该模型假定内切酶首先作用于基因的一端，从起点开始，基因转变频率由高到低形成一个梯度，在染色体上呈现基因转变极化现象的这样一个区域称为一个极化子（

polaron），有时一个极化子就相当于一个基因。6.5体细胞交换与基因定位6.5.1单倍体化与体细胞交换

一种绿色霉菌——构巢曲霉（

Aspergillus

nidulan），其分生孢子是单核的。将两个不同营养缺陷型菌株所产生的分生孢子大量混合接种在基本培养基的表面，可以得到少量的原养型菌落。由于这些原养型菌落细胞含有来自两亲本的细胞核，因此称为异核体（

heterokaryon）。

异核体：在同一个细胞质中含有两种或多种不同基因型的细胞核的细胞、孢子或菌丝体。

大量异核体中的核仍保持单倍体状态，但有少数单倍体细胞核融合成为二倍体细胞核或合核体（

synkaryon）。利用分生孢子颜色突变的遗传标记来鉴别一种菌落是二倍体还是异核体。如构巢曲霉野生型（

w＋

y＋

）分生孢子是绿色的突变型有黄色分生孢子（

w＋

y－

）和白色分生孢子（

w－

y＋

）

由产生黄色孢子的某一营养缺陷型（

A－

B＋

w＋

y－

）和产生白色孢子的另一缺陷型（

A＋

B－

w－

y＋

）组成的异核体的基因型为：

A－

B＋

w＋

y－/A＋

B－

w－

y＋

二倍体比异核体较为稳定，但是从大量二倍体分生孢子中也可以得到少数体细胞分离子（

segregant

）

，所谓分离子是重组体和非整倍体或单倍体的总称。在这里产生非整倍体或单倍体的过程称为单倍体化（haploidization)，产生重组体的过程称为体细胞交换（

somatic

crossing

over）。单倍体化是在有丝分裂过程中染色体不分离的结果。M

是决定细长刚

毛性状的显性基因

正常的体细胞有丝分裂两条染色体各自趋向一极，使两个子细胞中各有一条。导致了在表型上的分离现象。最初是Bridges观察果蝇杂合基因型M＋

M（M

是决定细长刚毛性状的显性基因）的雌蝇时，发现有些具有M

基因的雌蝇长出了一块扇形的野生型刚毛。表明杂合体的等位基因在表型上发生了分离。Bridges证明这是有丝分裂不分离（

mitoticnondisjunction）造成的［图6-19

（

a）]

。

2n＋

1也称为三体，它常失去一条染色体而成为二倍体。在此过程中，可以由杂合体转变为纯合体；2n－

1也称为单体，生长迟缓，且不稳定，常进一步失去其他染色体而最后成为一个稳定的单倍体［图6-19

（b)］

。

在单倍体化过程中，如果排除染色体携带的是某一个显性基因，那么相应的隐性基因所决定的性状就得以表现，这正像高等植物杂交在子一代中不分离，而在子二代中分离出隐性性状个体的原理一样。单倍体化过程使隐性性状表现，这种现象也称分离。此外，杂合体细胞中在有丝分裂后的子细胞核重建时，发生一条染色体丢失的现象称为有丝分裂染色体丢失（

mitotic

chromosome

loss）

，从而也导致表型的分离［图6-19（

c）］

。杂合二倍体的体细胞交换是产生分离子的第二个途径:例构巢曲霉的体细胞在有丝分裂过程中，同源染色体间却可发生染色体交换，即体细胞交换。由于体细胞交换可导致原杂合二倍体的部分基因纯合化，这种现象也称为有丝分裂交换（

mitotic

crossing

over）。构巢曲霉5个隐性基因paba（对氨基苯甲酸）y

（黄色孢子）ad16（嘌呤16）ad8（嘌呤8）bi（生物素）的杂合二倍体paba

y＋ad8＋／＋＋

ad16

＋

b

i为例，说明在发生体细胞重组后形成末端ad8与bi基因纯合二倍体的过程果蝇性连锁隐性突变基因Y（yellow

body

color黄体）

Sn

（焦刚毛，Short

twisty

bristles,

singed,Sn）

y+

Sn

/

y+

Sn

×

y

Sn+/

(纯合

灰体，焦刚毛)↓

（黄体，正常刚毛）

F1雌蝇大多数是野生型表现基因型：y+

Sn/y

Sn+

表型：灰体，正常刚毛

但某些雌果蝇有斑块（patches）

Single

yellow

spot

黄斑Single

singed

spot

焦刚毛斑块twin

spots

双斑

黄斑焦刚毛斑

mosaic

phenotypegp180（1）有丝分裂重组（Mitotic

recombination）

1936年Curt

Stern首先观察到

Mitotic

crossing-over以上这些不能用正常的基因分离进行解释。

也不能用染色体不分离或染色体丢失进行解释，因为这里观察到的变化是体细胞的（body

cells）,而不是种系（germline）的变化。对以上现象最好的解释是：mitotic

crossing-over

event所产生的结果如图5.15所示：某些细胞的有丝分裂中Y座位和Sn座位之间或Sn座位和着丝粒之间同源染色体发生了交换，也可能是双交换。

由于交换了的细胞形成的组织分别表现为:

黄斑、双斑、焦刚毛斑。最后一种斑的出现代表着双交换的结果，和减数分裂一样，双交换出现的频率最低。（2）有丝分裂交换的机理

Mechanism

of

Mitotic

crossing-over有丝分裂交换只能在二倍体细胞中进行研究。图(gp181f6.10)是一假设的杂合子细胞，在没有交换的情况下其一对同源染色体上所具有的基因的分离模式，亲本细胞和子代细胞在表现型上都为野生型。有丝分裂交换发生在类似于减数分裂四线阶段（Four-strand）。图GP181，6.11所示与图6.10相同的细胞类型，在基因c和d之间发生了有丝分裂交换。

从母本和从父本衍生而来的染色单体靠在一起形成一个四联体（tetrad），这类似于减数分裂的四线阶段，正是在这个时期发生交换。交换后，两对染色单体分离并独立迁移到赤道板上，导致了两种取向：

当类型（a）完成有丝分裂，产生两个二倍体细胞1和2，子代细胞1是纯合的d+

e+/d+

e+,因此表现为野生型，子代细胞2是纯合的de/de，在该性状上表现为突变型。（3）视网膜母细胞瘤

Retinoblastoma视网膜母细胞瘤是人类的一种肿瘤,可能是由有丝分裂重组引起的。

视网膜母细胞瘤是一种儿童眼癌

(gp183f6.12)常见于出生至4岁儿童中，若发现得早，90％以上的经λ射线照射，可以根除肿瘤。有两种形式的成视网膜细胞瘤：

一种是无家族史的“散发型”视网膜母细胞瘤（sporadicretinoblastoma,

nonhereditary）（60％的病例），自然产生，家族无该病的历史。单侧肿瘤（unilateral

tumor）即肿瘤只出现在一只眼睛中。

另一种是“家族型”（hereditary）视网膜母细胞瘤（40％的病例），对产生眼瘤的易感性（susceptibility）是遗传的。通常产生包括双眼的多种眼瘤（bilateral

tumors）。比散发型病人得病年龄早，这种家庭中，同胞兄弟姐妹和子女常常出现同样类型的肿瘤。

系谱分析得到的结果与单基因编码该病说法一致，1971年Alfred

Knudson提出了一个模型来解释散发型和家族型视网膜母细胞病的出现。

[“二次突变”学说two-hit

hypothesis,第一次突变型发生在生殖细胞期，第二次突变发生于分化的体细胞中]。他假设基因组中双拷贝的视网膜母细胞瘤基因（RB）独立地突变时产生视网膜母细胞瘤。

对于散发型视网膜母细胞瘤，他提出孩子出生时带有两份野生型基因拷贝（Genotype

RB+/RB+），然后两个突变发生在相同的成视网膜细胞中。因为在相同的细胞内出现两次这样突变事情的机会非常低，所以“散发型”多数产生单侧眼瘤。5.16

第一次突变产生RB/RB＋细胞（在家族型中已产生这种细胞RB/RB+）,第二次突变可能是在着丝粒与13P14之间发生

了有丝分裂交换，得到了一个突变等位基因的纯合子：6.5.2有丝分裂交换与基因定位基因定位：通过有性过程中细胞的减数分裂、同源染色体联

会、基因间的重组率来确定基因的位置。有丝分裂交换进行基因定位的原理：是依据体细胞同源染色体的交换使得染色体远端的杂合基因纯合化的规律，用来确定基因的排列位置和距离（图6

－22）

。

离着丝粒愈近

的基因纯合的

机会愈小，愈

远的则大，而

且着丝粒一端

的基因纯合不

影响着丝粒另

一端基因d的

纯合。因此，如果发现两个染色体臂上的基因同时出现纯合化现象，就有可能是一条染色体丢失的结果。

真菌在二倍体的有丝分裂过程中，偶尔发生同源染色体交换，导致连锁基因的重组，这一遗传变异过程称为准性生殖（

parasexuality）。准性生殖产生的重组体细胞一般和营养体细胞没有形态、生理上的差异，而且不产生在特殊的囊器中。

准性生殖过程中染色体交换和染色体的减少是不规律且不协调的，这便是准性生殖过程与有性生殖过程中基因重组的主要区别。通过有丝分裂定位得到的构巢曲霉的第一染色体右臂的各基因之间的图距如下：

染色体上面是有丝分裂数据，下面是减数分裂定位数据，两者定位数据相差甚远，这正是有丝分裂与减数分裂交换过程的基本差别，但二者在顺序上是一致的。

有丝分裂重组的频率比减数分裂的频率要低得多，有人认为这可能是由于有丝分裂中同源染色体只有某些部分发生配对的缘故。6.6体细胞融合与基因定位6.6.1细胞融合与基因定位

细胞融合（cell

fusion）:两个或几个体细胞融合成为一个细胞的过程。

是体细胞遗传学的核心内容

是应用体细胞遗传学技术进行基因定位的基础（1）体细胞的性质与细胞培养

体细胞系（somatic

cell

line）:从有性生殖的高等真核生物取其细胞进行离体培养，得到的培养物。用来培养的体细胞有两种类型：

一种是直接从动、植物正常组织中取得的细胞，染色体结构不变，细胞生活一个有限的时期，例：外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞等。（50代）

另一类是永久细胞系:可在体外无限制地培养。非整倍体、异常染色体。例：癌细胞、转化细胞等。细胞培养：模拟细胞在体内的生活条件,人为地提供一切必要的营养成分，保持一定的温度、酸碱度、渗透压并避免微生物的侵染等，使细胞在体外生长、发育、繁殖、传代，这就是细胞培养。细胞克隆

（cell

clone）：由一个细胞通过有丝分裂无性繁殖出来的一群细胞或建立的细胞系，它们在遗传上和表型上一致。体细胞突变细胞，表型有遗传突变的细胞（或直接从遗传病患者身上取得或直接从突变植株上取得）。

突变细胞是研究遗传代谢、基因功能的良好的材料。高等植物体细胞培养，可以再生成完整的植株（全能性

celltotipotency

细胞全能性）。(2)体细胞杂交（somatic

cell

hybridization）技术1958年Okada第一次将两个不同的肿瘤细胞＋仙台病毒（日本血凝病

hemagglutinating

virus

of

Japan，HVJ）

体细胞融

融合后的细胞称为杂种细胞（hybrid

cell），它含有两种细胞的染色体。体细胞融合与高等生物的受精不同，两个细胞的整个细胞质、细胞器都发生融合，合二为一。

仙台病毒（sendai

virus）在这里是促融因子，UV灭活的仙台病毒介导细胞融合过程，该病毒可进入细胞膜内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥（

cytoplasmic

bridge）

亦称HVJ（Hemagglutinating

virus

of

Japan的缩写），乙型副流感病毒。属副粘病毒属。仙台病毒是此属中最早分离到的。为多形态，直径150—600毫微。具包膜，其中含有分子量为6－7×106的RNA，但不是蛋白质合成的模板。不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。被感染的细胞株很易引起继发感染。仙台病毒

有几个附着点附着到宿主细胞，如果两个细胞靠近在一起，它就能同时附着到两个不同的细胞使得两个细胞的膜可以融合。因为具有融合各种细胞的能力，所以被广泛地用来进行细胞的异核体形成和培育杂种细胞。此病毒常存在于小鼠和猪中，另外也从人体中分离到与仙台病毒具有交换抗原的病毒（HA2等）。

聚二乙醇

(polyethylene

glycol,

PEG)：也可显著地提高细胞融合频率，将一定浓度的PEG加入到培养液内，就可使细胞发生凝集。由于PEG是非生物试剂，融合效率高，易于标准化，且价格便宜，因此PEG已成为广泛采用的融合剂，现已取代仙台病毒，它可使细胞膜部分降解，并在细胞间形成细胞质桥，可提高细胞融合的效率。细胞融合过程可分为异核体（

heterokaryon）和杂种（

hybrid）细胞形成两个阶段。

在异核体阶段融合的细胞内含有来自两个亲本的细胞核。随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。

杂种细胞具有染色体消减（chromosome

diminution）现象：随着分裂的不断进行，最初几代中包含了两种亲本细胞的全部染色体，在以后的增殖传代过程中要失落一部分染色体。失落的染色体的种类、多少及速度依亲本不同而有所不同亲缘关系远的种，染色体丢失得快，也丢失得多。例：小鼠－大鼠

杂种细胞

丢失大鼠的染色体10％－20％人－小鼠

杂种细胞丢失人的染色体，最后可能只剩下少数的几条或1条人的染色体。

在人－小鼠杂种细胞中，染色体经过丢失，数目达到稳定以后，由不同的单个的杂种细胞，可以形成许多带人染色体的杂种细胞无性繁殖系或细胞克隆（cell

clones）。这一特点为利用细胞杂种进行人的基因定位和基因表达的研究等创造了条件。（3）人－鼠杂种细胞的形成图6－23示人的成纤维细胞与已建立的小鼠细胞系形成杂种细胞的过程。二种细胞在含有PEG的液体培养基中混合悬浮液中培养。一旦细胞发生融合，形成双核异核体（binucleateheterokaryon）→核融合，形成融核体（合核体，synkaryon）→有丝分裂繁殖，每一个原始的合核细胞产生一个合核细胞克隆，能够用于各种研究。

显然人的各条染色体是以随机方式丢失的，因此也可得到多种不同染色体组合的杂种细胞株（表6

－8）

。通过分析某一基因产物与某一人的染色体是否共同存在而进行基因定位。这一方法的应用，改变了人类遗传学过去传统的依靠家系调查进行基因定位的方法，大大地加速了基因定位研究的进展。（4）HAT技术选择杂种细胞

如何将杂种细胞与它们的亲本细胞区别开，选择出来？

HAT

technique

/HAT

culture

medium(含Hypoxanthine

–

aminopterin

-

thymidine)次黄嘌呤氨基喋呤胸腺（胸腺嘧啶脱氧核苷）

利用只有杂种细胞由于合成核苷酸的从头合成途径被氨基喋呤阻断后，可利用补救途径合成

DNA（

核酸），细胞能够分裂繁殖生存，而非杂种细胞因其补救途径（应急途径）被HGPRT－、TK－阻断，不能合成DNA，不进行生长而死亡，来选择杂种细胞。1）DNA的生化合成途径：在细胞中核苷酸的生物合成有两条途径：一条是从头合成的主要途径，是由糖（核糖或脱氧核糖）加氨基酸进行合成。如果代谢拮抗物氨基喋呤（aminopterin）存在时，则这一途径受阻。但如果细胞中有由DNA或RNA降解而来的嘌呤或嘧啶存在时，在酶的作用下，形成核苷走第二条途径，即由核苷转化成核苷酸的补救途径（salvage

pathway）。（98）细胞中有两种酶：

胸苷激酶TK

（thymidine

kinase）

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

HGPRT（hypoxanthine

guanine

phosphoribosyl

transferase）

分别由基因TK＋和HGPRT＋编码，催化补救途径的主要途径。只有同时具有这两种酶的细胞才能进行补救途径的合成。2）

用小鼠的肿瘤细胞和人的成纤维细胞进行融合人的细胞：

基因TK＋和HGPRT――有用于pyrimidine

salvagepathway的胸苷激酶（TK）,而其用于purine

salvagepathway所需的HGPRT是有缺陷的。小鼠细胞：

基因TK－和HGPRT＋。存在aminopterin

(氨基喋呤)时，小鼠细胞和人细胞单独都不能生长，因为小鼠细胞不能合成它们所需的

pyrimidine

monophosphate,而人的细胞也不能合成它们所需的

purine

monophosphate。5.18融合了的杂种细胞能够在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基上生长，因为发生互补（complementation）。即小鼠的染色体贡献一个正常的HGPRT基因，人的染色体贡献一个正常的TK基因。HAT培养基含有hypoxanthine（次黄嘌呤是嘌呤的前体）和thymidine（它是一个嘧啶的前体）。因此两种酶能够合成，两条补救途径都能操作进行。（2）

营养缺陷突变型标记系统

CHO

细胞（Chinese

hamster

ovary

cell,中国仓鼠卵巢细胞）已产生了许多营养缺陷突变型，已知在人中国仓鼠细胞突变型杂种细胞中，人染色体也优先丢失。由于这种中国仓鼠细胞突变型属于营养缺陷突变型，因此只要将融合细胞群培养在不含有这一突变型所需成分的培养基上，就可去除未被融合的突变型细胞。在这种条件下选出的杂种细胞不仅可保留能够与CHO

细胞营养缺陷突变型发生互补的人类特异性染色体，而且还能保留其他人体染色体。利用含多条人染色体的杂种细胞更便于快速、系统地进行基因定位。3、细胞学图的制作

基因定位于染色体上在杂种细胞中人的染色体是随机丢失的，在HAT培养基上只有携带有TK＋基因的人染色体的杂种细胞才能生长，丢失TK＋基因的不能生长。分析了许多杂种细胞克隆知道，凡是能在HAT培养基上生长的杂种细胞克隆都共同具有人的第17号染色体，这表明TK基因就在人染色体17上。(图－3)G－带技术严格区分鉴别染色体。不同染色体G－带的大小和位置互不相同，但是每一条染色体的带型是高度特化和稳定的。另一方面小鼠和人的细胞融合后，有选择的丢失人类染色体，这样，通过分析基因产物（一般是酶），结合杂种细胞中存在的是人类某号染色体，就可以把控制该酶的基因定位于某号染色体上。5.196.6.2同线分析

用体细胞杂种进行基因定位有两个步骤：

第一，将某个基因定位于某一条染色体上，这称为染色体定（配）位（

chromosomal

assignment

）

；

第二，将该基因定位于某一染色体的具体位置上，这称为区域定（配）位（

regional

assignment

）

连锁分析原理用于体细胞杂种染色体分析的方法称为同线分析（

synteny

analysis）

其基点是：如果两个基因在一条染色体上，它们总是共同分离的；如果两个基因位于不同的染色体上，它们之间或多或少会发生自由组合。

如果是两种或两种以上的基因产物与某条染色体同时存在或同时丢失，就说明这两个基因在同一条染色体上，称同线（synteny），有的也把这种类型的测定方法称同线法。把基因定位在特定的染色体以后，就可以通过研究染色体畸变，如易位、缺失等进一步确定染色体上的具体区段。

例如有一个人鼠杂种细胞，是由一个具有两个突变基因（

A－

B－）的小鼠细胞系和一个具有两个相应的野生型基因（

A＋

B＋

）的人体细胞系融合而成。（a）两个基因位于同一条染色体上由于杂种细胞是无性生殖的，不会发生交换而产生A＋

B－

或A－

B＋

这两种重组类型相反，如A或B位于人的不同染色体上，它们的子代克隆中，有的克隆中只含两条人体染色体中的一条，或表现为A＋

B－，或表现为A－

B＋

。因此在这种情况下，子代克隆会出现A＋

B＋

、A＋

B－

、A－

B＋

和A－

B－

4种类型（

b）

。用这一方法就可以判断两个基因是否在同一条染色体上，也就是说它们是否为同线的。

根据同线分析原理，利用人体染色体和标记基因产物是否同时存在于某个人鼠杂种细胞株系进行染色体定位（表6－

8）。如果两个基因产物和某条染色体的存在有平行关系，表明它们具有同线性而位于同一染色体上。如表6

－8中杂种细胞株的葡萄糖磷酸变位酶1、肽酶C

和磷酸葡糖酸脱氢酶都与人的1号染色体存在平行关系，它们应是同线的，就可定位在1号染色体上。此外，异柠檬酸脱氢酶与苹果酸氧化还原酶则与2号染色体平行，可定位于人的2号染色体上。6.7真核生物基因的删除与扩增及重排6.7.1基因删除

某些原生动物，如线虫、昆虫和甲壳类动物等在个体发育中，许多体细胞常常丢掉整条或部分的染色体，只有将要分化形成生殖细胞的那些细胞一直保留全部染色体。通过丢失染色体，丢失某些基因而删除这些基因的活性的现象称为基因删除（

gene

elimination）。

如马蛔虫（

Ascaris

megalocephalus

）

受精卵细胞内只有一对染色体（2n＝

2）

，其上具有若干个着丝粒，在发育为成体的早期阶段，只有其中一个着丝粒行使功能，保证正常的有丝分裂。当个体发育到一定阶段后，在将要分化形成体细胞的那些细胞中，这对染色体破碎，形成许多小的染色体，而其中一些小染色体并不含着丝粒，因而在以后的细胞分裂过程中丢失，但是在那些将要分化形成生殖细胞的细胞中则不存在染色体破碎现象。

又如在小麦瘿蚊（

Mayetiole

destructor

）的个体发育过程中，其卵的后端含有一种称为极细胞质的特殊细胞质。

在极细胞质中的核保留全部40条染色体，但位于其他细胞质区域的核则发生染色体消减而丢失了32条染色体，只保留了8条。有40条染色体的细胞就分化

为生殖细胞而只有8条染色体的细胞继续增殖

成为体细胞

如用尼龙线结扎卵，使细胞核不能向极细胞质移动，或用紫外线照射极细胞质，那么所有的核都丢失32条染色体，其结果体内没有生殖细胞而发育成为不育的瘿蚊（图6－25）。极细胞质中何种物质可控制染色体丢失，而使生殖细胞的分化成为可能？分析表明在极细胞质中有含有丰富RNA的颗粒，它是核糖体颗粒的集合体。用离心的方法使这种颗粒移动，让极细胞质以外的核也接触到这种颗粒，结果这些细胞核的染色体就不再发生丢失。此外，紫外线照射可使极细胞质中这类颗粒性物质失活，使染色体消减而无法分化为生殖细胞。说明调控染色体丢失的主要物质是核酸。6.7.2基因扩增

基因扩增（

gene

amplification）是指基因组内某些基因的拷贝数专一地大量增加的现象。

它是细胞在短期内为满足发育或生理适应的需要而产生足够多的基因产物的一种调控手段，其实质是通过差别的基因复制（

differential

gene

replication）

而完成的。

例：爪蟾（

Xenopus

）

的卵母细胞便是通过rDNA的扩增而大量合成rRNA

体细胞rDNA

的拷贝数：500个

卵母细胞中的拷贝数约：2

000

000个

以供转录合成卵裂期所需要的1012个核糖体

爪蟾的rDNA单位，每一单位中包含18

S

rRNA基因、5.8

S

rRNA基因和28

S

rRNA基因，它们成簇存在，重复串联在一起形成核仁组织区（

nucleolar

organizer）

。高等真核生物中有4种rRNA，其中18

S、5.8

S和28

S

rRNA为主体rRNA，它们的基因组成重复单位；而5

S

rRNA

基因与主体rRNA

基因分隔开，独立成为串联重复单位，每个重复单位由5

S

rRNA基因和转录区之前的非转录区组成.

5

S

rRNA基因没有基因扩增现象

主体rRNA基因在卵母细胞中扩增后,以独立的染色体外分子形式出现，形成一个个环状rDNA小分子，每个环状rDNA分子可能来自基因组上的一个rDNA拷贝并含间隔区在内。

rDNA扩增就以此环状rDNA重复单位作为模板，以滚环方式进行复制。扩增后的rDNA虽然不在染色体上，但仍包含在核仁中，每一个核仁中包含一个复制单位，因此卵细胞核中的核仁数往往增加到几百个。当卵细胞成熟后，

rDNA便失去了继续存在的意义，因而非但扩增停止，而且所扩增的rDNA也开始逐渐降解。当受精卵分裂至数百个细胞后，这类染色体外的rDNA分子便完全消失了。

(1)由于发育过程的需要而出现基因扩增现象:在一些昆虫、两栖动物、鱼类的卵母细胞发育中和原生动物的大核形成过程中都观察到rDNA扩增;

(2)

外界环境条件的改变，也会造成基因扩增:在哺乳动物离体培养的细胞系中加入二氢叶酸还原酶（

dihydrofolatereductase，DHFR）的抑制剂氨甲蝶呤（

methotrexate，M

TX）后，可以使该酶的结构基因dhfr扩增达到40～

400个拷贝，于是细胞产生更高的酶活性来增强对氨甲蝶呤的抗性。6.7.3基因重排

基因重排（

gene

rearrangement

）是指DNA分子的核苷酸序列的重新排列，序列的重排不仅可形成新的基因，还可调节基因的表达。

酿酒酵母（

Saccharomyces

cerevisiae）中接合型（mating

types）的决定属于基因重排

单倍体酵母有两种接合型:

a

由基因Mata

（mating

的缩写）控制

α由基因Matα

所控制

一个单倍体细胞不是a型就是α型。

两个不同接合型细胞可接合，相同接合型细胞不能接合。

根据分泌物质的不同识别不同的接合型：

MATa细胞产生a因子，MATα

细胞产生α

因子，它们是促进不同接合型细胞相互接合的物质基础。接合后的二倍体细胞基因型为a／α，此杂合二倍体可产生MATa和MATα（图6－28）

但是a型可以转变

α型，α型

a型。这种相互转化的现象称为接合型互变（

mating

type

interconversion）。

Mat（接合型基因）位于酵母细胞的第3号染色体上，而接合型互变又依赖位于显性基因HO（homothallism，同宗接合，HO），它位于另一染色体上。

不管起始为哪种接合型，由于HO

基因的存在使酵母菌居群基因型发生变化，经几代后出现两种接合型细胞，并导致大量二倍体MATa／MATα

形成，于是由单倍体居群转变为二倍体居群。一个单倍体细胞同时存在着Mata和Matα

的遗传信息，