氨基酸工艺学

1作为谷氨酸发酵工业原料的水解糖液，必须具备以下条件：糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖浓度的要求糖液洁净，是杏黄色或黄绿色，有一定的透光度。水解糖液的透光度在一定程度上反映了糖液质量的高低。透光度低，常常是由于淀粉水解过程中发生的葡萄糖复合反应程度高，产生的色素等杂质多，或者由于糖液中的脱色条件控制不当所致。糖液中不含糊精。糊精并不能被谷氨酸菌利用，它的存在使发酵过程泡沫增多，易于逃料，发酵难以控制，也容易引起杂菌污染。糖液不能变质。这就要求水解糖液的放置时间不宜太长，以免长菌、发酵而降低糖液的营养成分或产生其他的抑制物，一般现做现用。2淀粉水解糖的制备方法比较酸解法(acidhydrolysismethod)酸解法又称酸糖化法。它是以酸(无机酸或有机酸)为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。优点：用酸解法生产葡萄糖，具有生产方便、设备要求简单、水解时间短、设备生产能力大等优点。缺点：水解作用是在高温、高压及一定酸度条件下进行的，因此，酸解法要求有耐腐蚀、耐高温、耐高压的设备。淀粉在酸水解过程中研发生的化学变化是很复杂的，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低。酸水解法对淀粉原料要求较严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。颗粒大，易造成水解不透彻;淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低，这些是酸解法存在的待解决的问题。酶解法(enzymehydrolysismethod)酶解法是用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。利用a-淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化(liquification)。利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解转化为葡萄糖，这个过程在生产中称为糖化(saccharification)。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故酶解法又有 双酶(或多酶)水解法之称(double-enzymehydrolysismethod)0优点：采用酶法制备葡萄糖，酶解反应条件较温和。因此，不需耐高温、高压、耐酸的设备，便于就地取材，容易运作。微生物酶作用的专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率(出糖率)高可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。用酶解法制得的糖液颜色浅，较纯净，无异味，质量高，有利于糖液的充分利用。缺点：酶解反应时间较长(48h)，需要的设备较多，需要具有专门培养酶的条件，而且酶本身是蛋白质，易引起糖液过滤困难。第二章氨基酸的发酵机制3氨基酸合成的调节-起调节作用的是关键酶。-关键酶是参与代谢调节的酶的总称。作为一个反应的限速因子，对整个反应起限速作用。这些酶常位于代谢流的枢纽之处，对代谢流的质和都起着制约的作用。-一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶可以成为关键酶，但关键酶并不都是分支点酶。关键酶的关键效果也只是在特定的氨基生物合成过程中成立，而在其它氨基酸的生物合成过程中则不成立。-在每个氨基酸的生物合成途径中，都有一种以上的关键酶。-生物合成的途径越长，关键的数目就越多。-关键酶中有的是变构酶，有的是同功酶，也有的是多功能酶。-对代谢流影最大的关键酶处于主导地位，常被配备在由同一前体物出发去生物合成多种氨基酸的关键点上。另外，关键酶所受的反馈调节因菌株而异。4反馈控制与优先合成氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制(反馈阻遏与反馈抑制)和在合成途径分支点处的优先合成。图9-24所示的反馈控制，由催化合成途径最初反应A-B的初始酶受终产物氨基酸E的反馈抑制和合成途径上各种酶受终产物氨基酸E的反馈阻遏组成。优先合成：底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶的酶活性远远大于b酶的酶活性，结果优先合成E。E合成达到一定浓度时，就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G合成达到一定浓度时就会对c酶产生抑制作用。5氨基酸合成的调节机制：通过控制有关基因表达的控制机制诱导:促进酶的合成。阻遏:抑制酶的合成，包括终产物阻遏、分解代谢物阻遏和弱化调节。通过酶活性的控制机制终产物抑制或激活。通过辅酶水平的活性调节。酶原的活化。潜在酶的活化。通过细胞膜渗透性的控制如棒杆菌、短杆菌积累谷氨酸过程中的细胞膜渗透性变化。第三章谷氨酸的发酵机制1谷氨酸生物合成途径谷氨酸的合成主要途径是a-酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。a-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主.(2)生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸.草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，最总终生成a-酮戊二酸。a-酮戊二酸还原氨基化反应生成谷氨酸。4谷氨酸积累的理想图景A一定的酵解速度，不能走向乳酸发酵B丙酮酸的碳架全部用于谷氨酸的合成。C：乙酰CoA全部趋于合成柠檬酸方向。F：异柠檬酸脱氢酶活性强；G：GHD强；H：强的细胞膜透性5.生物素在谷氨酸合成中的调节作用1） •生物素对糖代谢速率的影响生物素对糖代谢速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会起乳酸的溢出。2） 生物素对CO2的固定反应生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应，据报道，生物素大过量时（100ug/L以上）CO2，固定反应可提高30%。3） 生物素对乙醛酸循环的影响乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。以葡萄糖原料发酵生产谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。4） 生物素对细胞膜合成的调节作用。6细胞膜的渗透性的控制方法细胞膜通透性的控制方法大致可以分为两种类型：一类是通过控制磷脂的合成来控制细胞膜通透性。另一类是通过控制细胞壁的合成间接控制细胞膜通透性。控制磷脂的合成1） 生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成。作用机制:生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。2） 添加表面活性剂如吐温一60或饱和脂肪酸（C16一C18）使用生物素过量的原料（如糖蜜等）发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂（如吐温-60）或是高级饱和脂肪酸（C16一C18）及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸。作用机制:在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性。影响产酸的关键:必须控制好添加表面活性剂、饱和脂肪酸的时间与浓度，必须在药剂添加后，在这些药剂存在下，再次进行菌的分裂增殖，形成处于异常生理状态的产酸型细胞，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。3） 油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成。作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力;即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的通透性;通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外。控制的关键:对油酸缺陷突变株的谷氨酸产生菌来说，最重要的因素是细胞内的油酸含量，必须控制油酸亚适量，而细胞内生物素、棕榈酸等饱和脂肪酸的含量多少却影响甚微。若油酸过量时，则'长菌不产酸或长菌好产酸少’；只有在油酸亚适量的条件下，当油酸耗尽后，谷氨酸菌经再度倍增，发生细胞膜结构与功能上的特异性变化，除去谷氨酸向膜外漏出的渗透障碍物，谷氨酸才能高产。4） 甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成。作用机制:甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失a-磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成a-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜透性。控制的关键：必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物（添加0.02%）对于甘油缺陷型菌株，其细胞内的磷脂可以由添加甘油的数来调节。添加甘油过少，菌株生长不好，数量不够，周期长，产酸低甘油过量，磷脂合正常，只长菌不产酸或长菌好产酸低；只有控制甘油亚适量时，开始菌体正常生长，当甘油耗尽以后，通过再度增殖，细菌变形，细胞磷脂含量降为亲株的50%以下，从而破坏了细胞膜对谷氨酸的渗透障碍，使谷氨酸向膜外渗透。5） 温度敏感突变株机制：利用温度敏感菌株，当温度变化时，参与合成细胞膜结构的酶的遗传密码转换（A-T变G-C或反之）或颠换（A-T变为T-A或C-G变为G-C），使得合成的酶的失活，从而不能形成完整的细胞膜结构。控制关键：温度转换时间。阻碍细胞壁的合成作用机制：（抗生素）抑制细胞壁糖肽转肽酶活性，影响细胞壁糖肽的生物合成。控制关键：添加时间。2依据谷氨酸合成特点，提出发酵菌株选育方法（一）选育耐高渗透压菌株耐高糖选在20一30%葡萄糖的平板上生长好的突变株。耐高谷氨酸选育在15-20%味精的平板上生长好的突变株。耐高糖、高谷氨酸选育在20%葡萄糖加15%味精的平板上生良好的突变株。（二）选育不分解利用谷氨酸的突变株谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸。如果菌种一边合成谷氨酸，一边分解利用谷氨酸，就达不到积累谷氨酸的目的。所以必须使菌种不能分解利用谷氨酸，即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。（三） 选育细胞膜渗透性好的突变株抗Vp类衍生物据有关资料报道，抗Vp类衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改变细胞膜的渗透性。选育溶菌酶敏感性突变株谷氨酸菌对溶菌酶都不敏感。用溶菌酶破壁时，首先用青霉素预处理后才能破壁。如果经诱变处理，使菌种对溶菌酶敏感，就便菌种的细胞壁网状结构变得较松散，细胞壁对细胞膜的保护作用降低，渗透性变大。选育二氨基庚二酸缺陷型突变株二氨基庚二酸是谷氨酸菌细胞壁的组成成分，选育二氨基庚二酸缺陷突变株，限量添加二氨基庚二酸，使细胞壁合成不完整，细胞壁对细胞膜的保护作用降低，渗透性变大。选育温度敏感性突变株谷氨酸温度敏感突变株的突变位点发生在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上，常发生顺反子中碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为该顺反子所控制的酶对温度敏感，容易受热失活，即在低温下正常表达而在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。（四） 选育强化CO2固定反应的突变株选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株。以琥珀酸为唯一碳源，菌体要想生长，碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应。菌体生长越快，四碳二羧酸的脱羧反应越强，而四碳二羧酸的脱羧反应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的，所以以琥珀酸为唯一碳源，菌体长得越好，二氧化碳固定反应越强。选育氟丙酮酸敏感性突变株氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱，相对地CO2固定反应比例也就越大。（五） 选育减弱乙醛酸循环的突变株四碳二竣酸是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的，减弱乙醛酸循环，CO2固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高。2.选育不利用醋酸的突变株以醋酸为唯一碳源，菌种要生长，必须走乙醛酸循环。如果菌种不能利用乙酸，说明乙醛酸循环受阻。3利用基因工程技术，使异柠檬酸裂解酶活力降低。（六） 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到a-酮戊二酸代谢的突变株（七） 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株第五章谷氨酸发酵过程控制1生物素对Glu发酵的影响在谷氨酸发酵中，生物素的作用主要影响谷氨酸产菌细胞膜的谷氨酸通透性，同时也影响菌体的代谢途径。如果生物素过量，就大量繁殖而不产或少产谷氨酸，而产乳或琥珀酸。在生产中表现为长菌快，耗氧快，pH低，液氨消耗多。若生物素不足，菌体长不好，谷氨酸产量也低，表现为长菌慢，耗糖慢，发酵周期长。当供氧不足，生物素过量，发酵向乳酸发酵转换。供氧充足，生物素过量，糖代谢倾向于完全氧化。2溶解氧对发酵的影响好气发酵供氧主要包括化学工程学和微生物生理学两方面，在氨基酸发酵中，氧与C源和N源一样是需要大量供应的原料之一。（1） 生理学方面氧参与生物氧化获得ATP，能量参与谷氨酸合成。氨基酸合成过程中NAD（P）H2在氧存在下才能被氧化成NAD（P）。1） 能量获取：谷氨酸菌为好氧菌，在生长过程中，菌体的呼吸作用需要氧气，完成生物氧化，获得生长和菌体代谢的能量ATP。2） 代谢产物合成：氨基酸合成过程中需要氧气将还原态NAD（P）H2（还原酶）氧化成氧化态的NAD（P）（氧化酶）。当氧气不足，NAD（P）H2氧化受阻，谷氨酸生成受抑制。（2） 化学过程方面研究认为：当DOT（溶解氧）高于临界值时溶氧对微生物的呼吸速率没有影响；而当DOT低于该值时则呼吸速率下降。具体表现在：菌体生长期：1） 供养必须满足呼吸需要；2） 当溶氧低于临界氧分压时，菌体呼吸受抑制，乳酸积累增强，谷氨酸发酵受抑制；3） 高供氧时，菌体生长受抑制，菌体不能有效产生Glu。谷氨酸生成期：1谷氨酸发酵在细胞最大呼吸速率时，