神东培训分光光度法

第三章分光光度法

§1概述§2光的吸收定律§3分光光度计测定的方法§4分光光度法分析条件的选择

§3.1概述分光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分为包括可见分光光度法、紫外-可见分光光度法和红外分光光度法等。一、特点

1.灵敏度高一般吸光光度法所测定的下限可达10-5~10-6mol/L，因而有较高的灵敏度，适用于微量组分的分析。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。

2.准确度较高吸光光度法的相对误差为2%~5%，采用精密的分光光度计测量，相对误差为1%~2%，其准确度虽不如滴定分析法高，但已满足微量组分测定的准确度要求，而对微量组分的测定，滴定分析法是难以进行的。

3.操作简便，测定速度快

4.应用广泛几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。单色光：只具有一种波长的光。混合光：由两种以上波长组成的光，如白光。二、物质对光的选择性吸收白光青蓝青绿黄橙红紫蓝1、光的互补性与物质的颜色

物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的，物质的颜色由透过光的波长决定。例：硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以得白光，这两种光就叫互为补色光。物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光白光青蓝青绿黄橙红紫蓝2、吸收光谱或吸收曲线

吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。KMnO4

的吸收曲线最大吸收波长，max（1）、（2）（3）、（4）的浓度逐渐增大从吸收光谱图中看出:不同浓度的吸收光谱，形状基本一致，最大吸收波长都相同；还可以看到溶液浓度不同，吸收光谱的峰值不同，两者成正比关系。同一波长下，溶液浓度越大，则吸光度A越大，是进行定量分析的依据。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。吸收光谱体现了物质的特性，是进行定性、定量分析的基础。§3.2光的吸收定律—朗伯－比尔定律I0：入射光强度I：透过光强度c：溶液的浓度b：液层厚度T－透光率（透射比）A－吸光度1.透光率和吸光度当一束单色光透过均匀、无散射的溶液时，一部分被吸收，一部分透过溶液，即I0＝Ia＋It式中：I0为入射光的强度，Ia为溶液吸收光的强度，It为透过光强度。透光率，用符号T表示，即：T＝It/I0×100%透光度（率）的倒数反映了物质对光的吸收程度，应用时取它的对数做为吸光度，用A表示。即：

A＝lgI0/It＝lg1/T＝－lgT2.光的吸收定律：朗伯－比尔定律当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。

A＝abc朗伯－比尔定律不仅适用于有色溶液，也适用于无色溶液及气体和固体的非散射均匀体系；不仅适用于可见光区的单色光，也适用于紫外和红外光区的单色光。3.吸光系数a与入射光波长、溶液的性质及温度有关。当这些条件一定时，a代表单位浓度的有色溶液放在单位厚度的比色皿中的吸光度。吸光系数a

的讨论（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数（2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，a仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸光物质在不同波长下的a值是不同的。在最大吸收波长λmax处的吸光系数，常以amax表示

amax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力。

§3.3分光光度计光源单色器吸收池检测器和信号显示系统1.光源作用：提供能量，激发被测物质分子，使之产生电子谱带要求：发射足够强的连续光谱，有良好的稳定性及足够的适用寿命类型：可见与近红外区：钨灯400~1100nm

紫外区：氢灯或氘灯180~400nm一、主要部件作用：从连续光源中分离出所需要的足够窄波段的光束常用的元件：棱镜、光栅2.单色器功能：用于盛放试样，完成样品中待测试样对光的吸收常用的吸收池：石英（紫外区）玻璃（可见区）吸收池光程：1cm、2cm、3cm等注意：为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。吸收池要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。3.吸收池作用：接受、记录信号组成：检测器、放大器和读数、记录系统常用检测器：光电管和光电倍增管4.检测系统二、使用

1．开电源开关，打开箱盖，预热2．将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿(3/4),并用吸水纸擦干光面外壁3．选定波长4．打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空白管调T=0

5.盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏度开关) 8．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值A6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0，否则调节“消光零”旋钮调至0

4、分光光度法的定量分析方法：标准曲线法:将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度Excel作曲线AXCXA（吸光度）C（浓度）标准对照法

先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液（其浓度用Cs表示），在最大波长处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度Cs可按照下试求得：此法适用于非经常性的分析工作。§4分光光度法分析条件的选择一、显色反应及其条件二、测定波长的选择三、吸光度范围的选择四、参比溶液的选择1、显色反应及其条件可见光区的吸光光度法只能用于测定有色溶液。对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须加入一种能与被测组分反应生成颜色较深的有色化合物的试剂，然后再进行测定。

一、显色反应及其条件

显色剂一、显色反应及其条件显色反应：将被测组分转变成有色化合物的化学反应。显色剂：能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂。

显色剂必须满足下述条件：

（1）灵敏度要高：可见吸光光度法一般用于微量组分的测定，因此要求选择的显色剂能与待测组分生成摩尔吸收系数较大的有色化合物。生成的有色化合物的摩尔吸收系数越大，对入射光的吸收程度越大，测定的灵敏度就越高。（2）选择性要好：选用的显色剂最好只与待测组分发生显色反应，而与溶液中共存的其他干扰离子不显色，或者显色剂与被测组分所生成的有色化合物的颜色和显色剂与干扰离子所生成有色化合物的颜色有明显的不同。

（3）显色剂与被测组分生成的有色化合物要有足够的稳定性，不易受外界条件的影响而发生变化。（4）显色剂与被测组分生成的有色化合物的组成要恒定，符合一定的化学式，否则测定的再现性就较差。（5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足够大，一般要求相差60nm以上。2、显色条件的选择

（1）.显色剂的用量显色剂的适宜用量常通过实验确定，其方法是取7~10个相同浓度的被测组分的溶液，并固定其他条件，然后分别在溶液中加入不同量的显色剂，逐一测定吸光度，绘制吸光度A与显色剂浓度cB的关系曲线。吸光度与显色剂用量的关系（2）.溶液的酸度溶液的酸度对显色反应的影响主要表现在以下三个方面：①溶液的酸度对被测组分存在状态的影响：大多数被测金属离子易水解，当溶液pH增大时，可能生成各种类型的氢氧基配合物，甚至生成氢氧化物沉淀，使显色反应不能进行完全。

②溶液的酸度对显色剂的平衡浓度和颜色的影响：大多数显色剂是有机弱酸或有机弱碱，当溶液的pH变化时，将影响显色剂的平衡浓度，并影响显色反应的完全程度。另外，有一些显色剂本身就是酸碱指示剂，它们在不同pH的溶液中具有不同的结构，而产生不同的颜色，所以对显色反应也有影响。③溶液酸度对有色化合物组成的影响：在不同pH的溶液中，显色剂与待测离子形成的有色化合物的组成往往不同，其颜色也不同。必须控制合适的pH，才能获得好的分析结果。

不同的显色反应的适宜pH是通过实验确定的。具体方法是:固定溶液中被测组分和显色剂的浓度，改变浓度的pH，测定此pH下溶液的吸光度，以pH为横坐标，以吸光度为纵坐标，作出pH与吸光度的关系曲线，从中可找出适宜的pH范围。pH与吸光度的关系曲线

(3).显色温度显色反应一般在室温下进行，但有些显色反应需要加热到一定温度时才能完成，而有些化合物当温度较高时又容易发生分解。对不同的显色反应，应通过实验找出各自的最佳温度范围。(4).显色时间通过实验来确定合适的测定时间。实验的方法是配制一份待测溶液，从加入显色剂起计算时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘制A-t关系曲线，根据曲线选择合适的测定时间。

二、测定波长的选择

选择溶液具有最大吸收的波长λmax作为入射波长。在λmax处A最大，使测定具有较高的灵敏度；同时，在λmax处的一个较小范围内，吸光度变化较小，不会偏离Lambert-Beer定律，也使测定具有较高的准确度。如果干扰物质在λmax处也有强烈吸收时，可选用非最大吸收处的波长，但应尽可能选择A随波长改变而变化不大的区域内的波长。

三、吸光度范围的选择

在吸光光度分析中，分光光度计的读数误差也是测定误差的主要来源之一。对于同一台仪器，透光率读数的绝对误差基本上为一定值。由于透光率T与试样溶液浓度cB之间为对数关系，因而在不同的透光率读数范围内，这一恒定误差所引起的浓度cB的测定的相对误差是不同的。不同透光率时测定浓度的相对误差ΔcB/cB(ΔT=0.01)T/%95908070605036.83020105220.610.75.64.03.32.92.72.83.24.36.513.0测定相对误差与透光率的关系

在T=36.8%（A=0.434）时，浓度测定的相对误差最小。在实际测定时，常将吸光度控制在0.2~0.7（T=20%~65%）之间，以减小浓度测定的相对误差。四、参比溶液的选择I0参比样品未考虑吸收池和溶剂对光子的作用原则:使试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。利用空白试验来消除因溶剂或器皿对入射光反射和吸收带来的误差。（1）如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂（或蒸馏水）作参比溶液（2）如果显色剂或其他试剂略有吸收，应用空白溶液（包括显色剂或其它试剂不加待测试样溶液）作为参比溶液。（3）如试样中其它组分有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作为参比溶液；当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。

定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲。偏离朗伯一比尔定律的原因

01234mg/mLA。。。。*0.80.60.40.20工作曲线一、物理因素(1)比尔定律的局限性

比耳定律假设了吸收粒子之