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文档简介

职业教育医学检验技术专业教学资源库生物化学检验技术核酸分离纯化技术BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE2标本：血液、尿液、唾液、分泌物、组织及培养细胞DNARNA核酸质量要求结构完整、纯度、浓度核酸分离纯化方法选择原则：1、保证核酸分子一级结构的完整性;2、排除其他分子污染。根据不同标本性质、起始量以及待分离核酸性质、用途采用不同的分离纯化方案。2023/5/16核酸分离纯化方法选择（一）影响核酸一级结构因素物理因素温度0-４℃

避免反复冻融、高温防止其他机械剪切力的作用例如基因组DNA分子细长，容易受到机械剪切力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离大分子线性DNA的主要危险因素。

化学因素

pH４-1０，避免酸碱对核酸磷酸二酯键的破坏生物因素

避免核酸酶（DNA酶和RNA酶）破坏

采取措施：操作环境洁净、操作者戴手套防止外来污染；所有器械及一些试剂应进行高温灭菌处理；提取缓冲液加入核酸酶抑制剂。

DNA酶抑制剂

大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如Ca2+,Mg2+等，因此加入EDTA（乙二胺四乙酸钠），8-羟基喹啉等金属离子螯合剂可抑制DNA酶活性；阴离子表面活性剂SDS，抑制DNA酶活性并沉淀蛋白。

RNA酶抑制剂（1）DEPC（焦炭酸二乙酯）

强烈的RNA酶抑制剂，可与RNA酶组氨酸残基结合，抑制RNA酶活性。

剧毒易降解、需保存于低温使用时，0.1%DEPC浸泡器械过夜或37

℃浸泡2h以上破坏单链核苷酸嘌呤环结构，但有效浓度比蛋白变性浓度高100-1000倍

（2）其他RNA酶抑制剂肝素复合硅酸盐RNase阻抑蛋白（RNasin）氧钒核糖核苷复合物

异硫氰酸胍

（二）影响核酸纯度的因素

多糖、蛋白质、脂类有机溶剂、金属离子其他非目的核酸的核酸类物质

核酸分离纯化技术路线

细胞裂解核酸提取核酸纯化步骤一：细胞裂解物理法：超声波法、研磨法、匀浆法、冻融法

化学法：表面活性剂SDS、高盐酶法：溶菌酶、蛋白酶K、裂解酶

破坏细胞膜结构，释放胞内核酸，同时可降解核酸结合蛋白，促进核酸提取。

步骤二：核酸提取蛋白质是核酸分离提取最大污染，将与核酸紧密结合的蛋白质分离且保证核酸结构完整，是核酸分离提取的技术关键。常用核酸提取方法高盐法（高浓度NaCl）NaCl加入，破坏核酸-蛋白静电吸附力、氢键，使其解聚；RNA核蛋白与DNA核蛋白在NaCl溶液中溶解度不同，可以通过调节NaCl溶液浓度分离RNA核蛋白与DNA核蛋白。

SDS法SDS可裂解细胞、抑制核酸酶活性，还是蛋白质变性剂，使得核酸结合蛋白变性解离，促进核酸提取。酚-氯仿抽提法

酚:氯仿：异戊醇=25:24:1酚：蛋白质变性剂，DNA酶抑制剂氯仿：加速有机相与水相分层，去除酚异戊醇：降低表面张力，减少气泡，使离心后水相、有机相、变性蛋白层相对稳定

步骤三：核酸纯化

通常采用沉淀法浓缩纯化核酸

（1）易于改变核酸溶解缓冲液；

（2）易于调整核酸浓度；

（3）易于除去核酸中残余盐离子和杂质。沉淀剂一：盐NaA

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