氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷一、 采样与样品预处理（同微生物生物量碳）土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物（如蚯蚓）等,然后迅速过筛（2〜3mm）,或放在低温下（2〜4°C）保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下（2〜4C）最好不要超过10d。二、 方法一氯仿薰蒸浸提法（FE）1、 方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的磷大幅度增加。通过测定浸提液中磷的增加量，估算土壤微生物量磷。浸提液中磷用钼锑抗比色法测定。2、 仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200rev/min）；冰柜；分光光度计3、 试剂无乙醇氯仿：量取500mL氯仿于1000mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[9（H2SO4）=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。（试剂浓硫酸9（H2SO4）=95~98%，稀释19倍）2.0.5mol/LNaHCO3：42.0gNaHCO3（化学纯）溶于800mL水中，用0.5mol/LNaOH调节溶液的pH至8.5,用去离子水稀释至1L。溶液贮存于塑料瓶中。长时间放置，使用前必须检验pH值。钼锑抗试剂：称取酒石酸锑钾0.5g，溶解于100mL水中，制成0.5%的溶液。另称取钼酸铵10g，溶于450mL水中，徐徐加入153mL浓^Sq，边加边搅。再将°.5%的酒石酸锑钾溶液加入到钼酸铵溶液中，最后加水至1L，充分摇匀，贮存于棕色瓶中。临用前（当天），称取左旋抗坏血酸1.5克（Vc，三级），溶解于100mL钼锑贮备液中，此溶液有效期为24h。磷标准溶液：准确称取在105C烘箱中烘干的KH2PO4（分析纯）0.4394g，溶解在400mL水中，加浓H2SO45mL（防止发霉），转入皿容量瓶中，定容，摇匀。此溶液为100mg/LP标准溶液，在4°C冰箱中可长期贮存。吸取磷标准溶液5mL，稀释至100mL，即为5mg/LP标准溶液（不宜久存）。250ug/mLKH2PO4：0.5492gKH2PO4-定容至500ml水；0.10984g定容至100ml。硫酸溶液（2.5molL-1）：量取70.0ml分析纯浓硫酸，稀释至500ml。1molL-1NaOH:称取40g分析纯氢氧化钠，溶于1L蒸馏水中。2,6二硝基酚指示剂：称取0.2g指示剂溶于100ml水中。4、操作步骤4.1薰蒸称取相当于5.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有50mLNaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯（根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片），用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2min。关闭干燥器的阀门，在25oC的黑暗条件下放置24h。打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，用NaHCO3溶液（见下一步骤，试剂2）浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周，4C下放置1个月或在-15oC下保存。4.2浸提薰蒸结束后，将土壤全部转移到250mL的震荡瓶中，加入80mL0.5mol/LNaHCO3溶液，在振荡机上振荡浸提30min（25C，185rev/min），用无磷滤纸过滤。薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，同上用0.5mol/LNaHCO380mL溶液浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液立即测定或在-15oC下保存。P回收率测定另取等量土壤3份，加入0.5mL250ug/mLKHPO（50ugP/g土），同上加入80mL0.5mol/L2 4NaHCO3溶液浸提，浸提液在室温下可以放置1周，4C下放置1个月或在-15£下保存。4.3测定吸取土壤浸提液25mL（根据土壤含磷量进行调整）于50mL容量瓶中.调解pH：加2,6-二硝基苯酚1-2滴，用3mol/L的硫酸把溶液调至无色。回滴用1mol/L的NaoH溶液。缓缓加入钼锑抗溶液5mL(试剂3),边加边轻轻摇动(防止溶液溢出)，全部排除溶液中的CO2。加去离子水定容。静置0.5h后(如果温度太低，显色比较缓慢，可以在水浴中加热)，用分光光度计在880nm波长下比色。标准曲线绘制：分别准确吸取5mg/L磷标准溶液(试剂4)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL容量瓶中，再加入NaHCO3溶液(试剂2)10mL。调pH(同4.3上)。加入钼锑抗溶液5mL，静置0.5h比色。4.4测定土壤含水量：称5.00g上述湿润土壤，放在铝盒中，在105°C烘箱中烘8h，然后称其干重。(三个平行)。5、结果计算熏蒸和未熏蒸浸提的磷量(mg/kg)P(mg/kg)=显色液P(mg/kg)X显色液体积Xts/DW式中：显色液P(mg/kg) 标准曲线中查得显色液的P(mg/kg)数；显色液体积 50mL；ts——分取倍数(浸提液总体积/吸取浸提液体积)DW一土壤的烘干质量，g。生物量磷(Bp)的计算Bp=(F-UF)/(KpXR)式中：F一熏蒸浸提的磷量(mg/kg)；UF 未熏蒸浸提的磷量(mg/kg)；Kp一提液微生物生物量磷占总微生物生物量磷的比例，为0.4；R(%)—