卫生微生物课件第三章 卫生微生物学研究和检测方法

第三章

卫生微生物学研究和检测方法

1.卫生微生物检验与医学微生物检验的区别与特点?2.样品的采集原则？3.影响采样代表性的因素有哪些？4.怎样使采样具有针对性？5.样品采集后为什么要尽快送检？6.怎样保护样品中的待检微生物？7.样品中抑菌物质去除方法有哪些？8.样品的处理策略（目的）与方法9.怎样浓缩样品中的微生物？10.环境中的微生物数量低，怎样提高检出率？11.怎样进行卫生安全性评价？第一节卫生微生物学检测特点及基本原则一、卫生微生物检测的特点

检测对象多致病微生物非致病微生物条件致病微生物检测范围广标本来源多人：个体及群体环境健康相关产品检测目的特殊检测方法灵敏浓缩去除不利因素查明突发公共卫生事件的原因（定量测定和分型检测）卫生质量监测与安全评价（卫生指示微生物）indicatormicroorganism二、卫生微生物检测的基本原则

采集保存运送检测基本原则样品种类感染标本正常人体标本卫生样品食品、化妆品、水产品、消毒及卫生用品、水、土壤、空气等（一）样品的采集原则代表性与针对性采样部位采样方法采样时间采样的随机性采样量采样的注意事项

避免外源性污染避免对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质注意加入中和剂采样记录影响采样代表性的因素采样量：采样部位：采样时间：避免对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质（二）卫生样品的运送原则？1.尽快送检！！！

多快？一般不超过3～4h

为什么？减少待测微生物的死亡。防止微生物的繁殖对计数结果的影响。（二）卫生样品的运送原则1.尽快送检2.注意保护待检微生物温度、加入保护剂、运送培养氧气、防止溶血3.注意生物安全密封，避免泄露4.完善的样品交接实验室收样应按送检单逐项核对（三）实验室检验原则1、相应的硬件条件和设备2、合格的检验人员3、标准/公认的检验方法4、实验室质量控制5、微生物检验优先1、相应的硬件条件和设备微生物危害度分级致病力、传染性、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等危害等级Ⅰ：低个体危害，低群体危害危害等级Ⅱ：中等个体危害，有限群体危害危害等级Ⅲ：高个体危害，低群体危害危害等级Ⅳ：高个体危害，高群体危害生物安全防护水平分级

生物安全防护水平(BSL)分级生物安全防护水平BSL-1BSL-2BSL-3BSL-4protect

P1P2P3P4实验室的生物安全防护

ABSL-1ABSL-2ABSL-3ABSL-41、相应的硬件条件和设备2、具有合格的检验人员人员的资质与培训1、相应的硬件条件和设备2、具有合格的检验人员3、标准/公认的检验方法GB、规范等没有GB或部颁标准，按上级CDC要求1、相应的硬件条件和设备2、具有合格的检验人员3、标准/公认的检验方法4、加强实验室质量控制（质量保证体系样品受理部门样品检测部门出具检验报告的部门监督检查部门

第二节

卫生微生物学研究和检测的方法

学习内容：样品处理损伤菌的复苏增菌与分离定量计数分型鉴定一、样品处理均质化乳化后再行稀释去除抑菌物质浓缩目的菌一、样品处理（1）均质、混匀：液体样品电动混合、手摇混合或敲打、震荡；固体样品灭菌乳钵内研磨均匀、高速组织捣碎机或匀浆器；油性样品乳化+

均质为什么要均质？有利于取样的代表性样品内部的待测微生物释放但混合的时间不宜太长和过猛？一、样品处理（1）均质化（2）去除抑菌物质中和法过滤法稀释+过滤一、样品处理（1）均质化：（2）抑菌物质去除（3）浓缩目的菌沉淀离心法过滤法吸附沉淀法免疫磁珠法

相应的抗体连接于磁珠-菌体复合物二、损伤菌的复苏(resuscitation)为什么要复苏？受冷、热、脱水干燥、辐照、高渗透压或防腐剂、消毒剂的作用，可能引起亚致死性损伤方法

采用无选择压力培养基增菌改变培养温度、时间

先在25～37℃修复12h，在转入选择性培养基活菌数测定时，降低培养温度至30～32℃

延长培养时间：48h在选择性培养基中加入中和剂三、增菌与分离物理方法

高温或低温，有氧或无氧，有或无光照化学方法改变盐的浓度嗜盐菌培养基7.5%氯化钠肉汤加入抑菌剂胆盐、煌绿、多粘菌素B等最常用：选择性增菌与分离？卫生微生物样品特点：

目的菌数量低

细菌受损

杂菌多数量低——浓缩细菌受损——复苏杂菌多——选择性增菌和分离四、定量计数方法倾注平板计数法表面涂布计数法MPN法（最可能数法）比浊计数法

显微镜直接计数法微菌落快速计数法倾注平板计数法测定样品中细菌、霉菌和酵母菌等数量最常用的方法CFU/ml(或g)卫生微生物检验基本技术之一稀释注意事项稀释、加样要精确倾注琼脂培养基温度约45℃左右混匀2~3个平行板选择适宜系数度计数细菌选择30~300cfu计数霉菌选择30~100要设立空白对照稀释液+培养基菌落计算方法（1）菌落计数方法肉眼观查，必要时用放大镜检查，求出各稀释度的平均菌落总数。平板菌落数的选择一个稀释度使用两个平板，计算平均数其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数平皿内如有链状菌落生长时，一条链，可视为一个菌落数稀释度的选择应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度若有两个稀释度的菌落数均在30～300之间，则视两者之比来决定比值小于或等于2，应报告其平均数若大于2则报告其中较小的数字平均菌落数均大于300，按稀释度最高者报告平均菌落数均小于30，按稀释度最低者报告均无菌落生长，以＜1乘以最低稀释倍数报告均不在30～300之间，则以最接近30或300的平均菌落数报告菌落数的报告平均菌落数乘以稀释倍数报告菌落数在100以内时，按其实有数报告大于100时，采用二位有效数字，也可用10的指数来表示。表面涂布计数法表面涂布计数法特点加样量小可使用不透明培养基对细菌计数培养基成分不耐热营养成分鉴定成分抑菌成分菌落需再进行证实试验可避免因热琼脂对待检菌的损伤表面涂布计数法注意事项涂布要均匀加量不宜过多MPN法（最可能数法）10-110-210-3查MPN表MPN法特点半定量法样品中混有其它细菌，无法采用平板菌落计数特别适宜对菌数少的样品进行选择性计数目前MPN法的应用食品中的大肠菌群的计数：9管法水中的大肠菌群的计数：15管法食品中的金葡菌的计数：9管法水中的粪大肠菌群、产气荚膜梭菌的计数显微镜直接计数法Breed计数法0.01ml菌液计数板方格中干燥固定亚甲兰染色油镜观察计数

比浊计数法原理细菌悬液的浊度与菌数成正比方法最常用的标准比浊管是麦氏比浊管分光光度计测定法准比浊管及其相应菌数管号123456789101%BaCl2（ml）0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01%H2SO4（ml）9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0相当的菌数（109/ml）36912151821242730微菌落快速计数法加样0.1～1ml→醋酸纤维素薄膜→培养基衬垫→37℃、5h→取下膜→玻片上加热干燥→透明液中30sec→贴玻片上→加热使其完全透明→结晶紫染色→水洗后低倍镜下镜检→计数形成的微菌落→推算标本中的微生物数量。滤膜过滤法常用于水样的检测五、分型鉴定的方法血清学分型噬菌体分型细菌素分型耐药谱分型质粒图谱分型通过分析质粒的数量、大小和特征进行分型分型和鉴定的基础是分析质粒图谱。质粒指纹图谱质粒酶切图谱毒素分型

脉冲场凝胶电泳分子分型

六、其他分子生物学方法PCR核酸杂交G+C含量测定基因芯片(genechips)蛋白质芯片（proteinchips）第三节卫生指示微生物指示微生物定义与分类indicatormicroorganism定义：是在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状况及安全性的微生物。指示微生物分类①菌落总数、霉菌和酵母菌数评价被检样品的一般卫生质量、污染程度和安全性②大肠菌群、粪链球菌、产气荚膜梭菌等评价检品受人、畜粪便的污染状况间接反映肠道病原微生物存在的可能性③某些特定环境不应检出的菌类(如特定菌、某些致病菌、或其它指示性微生物)④病毒（包括噬菌体）间接反映肠道病毒存在的可能性。一、指示微生物的选择（1）总则（选择标准）数量大、易检出检验方法简单、经济、方便；有一定的代表性，其数量变化能反映样品卫生状况及安全性，即数量越大，污染越严重，安全性越低。二、指示微生物的选择（2）粪便污染指示菌的选择原则①是人及温血动物肠道的正常菌群，且数量大②在外环境中存活时间与肠道致病菌大致相似或稍长③排出体外后，在外环境中不繁殖④在污染的样品中易检出，未污染的样品中不易检出⑤对常用饮用水消毒剂（如氯、臭氧）的抵抗力应该不低于或略强于肠道致病菌⑥检验方法简便，易于定量计数。三、检测指示微生物反映样品卫生安全性的原因①致病微生物种类繁多，检测方法多，不可能分别检测各种微生物②分离、鉴定需时长，不能满足实际需要③分离、鉴定费用高，技术要求高④致病微生物的数量少，而检测方法的灵敏度不高，可能导致假阴性结果。通常以检测指示微生物间接反映样品的安全性四、常用的指示微生物1.菌落总数2.粪便污染指示菌3.致病菌4.肠道病毒的指标微生物

1.菌落总数定义是指被检样品的单位重量(g)、容积(ml)、表面积(cm2)或体积(m3)内，所含有的能在某种培养基上经一定条件、一定时间培养后长出的菌落数量。所得菌落总数只包括那些能在普通营养琼脂中发育、嗜中温、需氧和兼性厌氧的细菌，不包括厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌及一些有特殊营养要求的细菌。1.菌落总数定义单位：cfu/g、cfu/ml、cfu/cm2

、cfu/m31.菌落总数定义单位种类细菌菌落总数霉菌菌落总数酵母菌菌落总数1.菌落总数定义单位种类卫生意义用于判定检样被微生物污染的程度，是某些样品的卫生限量标准。

1.菌落总数定义单位种类卫生意义测定方法标准平板倾注法表面涂布法细菌总数的检测

检样（25g或ml）↓做成几个适当倍数的稀释液↓选择2～3个适宜稀释度各以1ml分别加入无菌平皿内（每个稀释度两个平皿）↓每皿内加入适量平板计数琼脂36±1℃↓48±2h菌落计数↓报告平板倾注计数稀释加板、培养计数细菌菌落总数检样↓做成几个适当倍数的稀释液↓选择2～3个适宜稀释度各取0.1ml或适量，置于装有培养基的平皿中央（每个稀释度两个平皿）↓用L玻棒遍涂均匀36±1℃↓48±2h菌落计数↓报告表面涂布计数法

2.粪便污染指示菌包括大肠菌群、耐热大肠菌群大肠杆菌粪链球菌产气荚膜梭菌大肠菌群、耐热大肠菌群大肠菌群（coliformgroup）

定义：是一群能在37℃、24h内发酵乳糖产酸产气的、需氧或兼性厌氧的、革兰阴性的无芽胞杆菌。主要包括四个属埃希菌属(Escherichae)克雷伯菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)枸橼酸杆菌属（Citrobacter）耐热大肠菌群（粪大肠菌群）在44.5℃仍能生长的大肠菌群大肠杆菌普遍存在于人和动物的肠道内新鲜粪便中可达109/g若在环境中发现，可认为被人和动物的粪便污染由于大肠杆菌的鉴定方法比较复杂，用“大肠菌群”代替“大肠杆菌”但近年来随着新方法建立，大肠杆菌的应用越来越多如美国环境保护署（EnvironmentalProtectionAgency，EPA）2000年颁布对大肠杆菌数进行测定。

大肠菌群类型及卫生意义总大肠菌群37℃生长的大肠菌群耐热大肠菌群44.5℃仍能生长的大肠菌群指示意义：作为被人、畜粪便污染的评价指标

大肠杆菌＞耐热大肠杆菌＞总大肠菌群大肠菌群的检验方法多管发酵法（最可能数法，MPN）滤膜法纸片法MPN值的获得2.查MPN值