年产300吨螺旋霉素课程设计

1绪论螺旋霉素，英文名Spiramycin。白色或微黄色粉末，微有味；微吸湿；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，难溶于水。该品系多组分大环内酯类抗生素，具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应（PAE），能够增强吞噬细胞的吞噬作用，广泛分布于体内。本品在组织细胞内浓度较红霉素高，而副作用小于红霉素。与红霉素有交叉耐药。对革兰阳性菌和一些革兰阴性菌如链球菌、脑膜炎双球菌、百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌等包括对青霉素、链霉素、四环素、氯霉素耐药菌均有效。螺旋霉素是多组分的抗生素，其主要成分包括螺旋霉素I、II、III。其发酵液中组分I含量最高，为60％；其次是组分II含量，为24％；最后是组分III含量，为13％。各组分活性相近。螺旋霉素是3种组分的复合物，复合物为奶油色、味苦的无定形碱性抗生素。可溶于氯仿、醇类、己烷、苯、酮、醋酸酯，微溶于水。其硫酸盐溶于水和低级醇。熔点：组分I为134～137℃：组分II为130～133℃；组分III为128～131℃。在231-232um处有紫外吸收峰，本身带有发色基团。遇浓硫酸或盐酸呈紫色反应。麦芽酚反应、茚三酮反应、坂口反应、双缩反应、斐林反应均为阴性。多年来，在我国药品市场中，抗感染药物的销售额始终位居第1，目前年销售额已达400多亿元人民币，占全国年药品销售总额的30%左右。在抗感染药物市场中，大环内酯类抗生素是主力军之一，在今后的发展中，我国的医疗保障系统将会更完善，对螺旋霉素及其衍生物的需求也会加大。一般菌种分离纯化和筛选的步骤如下：采样采样材料预处理分离所需菌种培养菌种菌落选择菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种保藏用产二素链霉菌SIPI9004生产螺旋霉素。琼脂培养基/%：葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.0，麸皮1.0，MgSO4・7H2O0.05，CaCO30.3，琼脂2.0；pH7.0，28℃种子培养基：葡萄糖，淀粉，黄豆饼粉，酵母粉，NaCl，CaCO3；pH7.0，斜面孢子挖块接种，摇瓶置于旋转摇床(230r/min)，28℃发酵培养基：淀粉，鱼粉，酵母粉，NaCl，NaNO3，KH2PO4，CaCO3；pH6.5，取种子培养液10%移种于发酵摇瓶中，摇床(230r/min)，28℃总糖：用费林法测定。菌体浓度：取发酵液10ml置于刻度离心管中，离心(3000rmin)10min，测定菌丝体湿重。发酵单位：取发酵滤液用杯碟法测定，藤黄八叠球菌为检定菌。单孢子悬浮液制备：新鲜孢子斜面加入无菌生理盐水，洗下的孢子经滤纸过滤，镜检单孢子分散度达到97%以上方可用于诱变处理。吸取单孢子悬浮液6ml培养皿，置于30W的UV灯(253.7nm)下30cm处，振动照射处理，杀死率控制在90%左右。2.6初筛用氨基乙酸和缬氨酸作为筛选剂，以适当浓度分别加至琼脂培养基中，制成不含药物平板及药物浓度梯度平板。将诱变后存活孢子涂布于上述平板上，恒温培养；UV处理的和不处理的孢子，分别涂布于不含药物的琼脂培养基平板上培养作对照。分别选取单菌落传斜面培养。斜面挖块移种种子瓶培养；以10%接种量移种发酵瓶发酵培养，发酵滤液作生物效价测定，去劣留优。高产菌株为突变的产二素链霉菌SIPI9004生产螺旋霉素。3菌种保藏菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法、液氮超低温保藏法。真空冷冻干燥法：是目前比较理想的一种方法。在低温-15°产二素链霉菌遗传极不稳定，在培养过程或菌株保藏中，常发生变异，故采用真空冷冻干燥法。4培养基的配置培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上①满足必须的原料；②生化反应的基本条件（温度、溶氧和批pH）；③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；④培养基成分不影响下游产品的提取加工。培养基可以按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基。种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。发酵培养基发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。孢子培养基琼脂培养基%：葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.0，麸皮1.0，MgSO4・7H2O0.05，CaCO30.3，琼脂2.0；pH7.0，28℃种子培养基(g/L)淀粉30，黄豆饼粉20，葡萄糖5，磷酸二氢钾0.5，蛋白胨6，豆油5，氯化钠4。以温度28±℃，220r/min培养。发酵培养基(g/L)淀粉70，黄豆饼粉15，玉米浆7，动物蛋白NY5，糊精12，氯化钠4，硝酸铵6，碳酸钙5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁1，豆油3。以温度28±℃，接种量8%，220r/min培养96h。碳源碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要功能有两个：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必须的碳成分；二是为合成目的产物提供所需的碳成分。发酵条件研究发现：不同碳源中以淀粉最好，糊精次之，最差是蔗糖和乳糖。本设计中发酵培养基所用碳源为淀粉与葡萄糖。氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物。常用的氮源分为有机氮源和无机氮源。本设计的发酵培养基中的有机氮源是黄豆饼粉、玉米浆和鱼粉；无机氮源是硝酸铵。无机盐和微量元素无机盐和微量元素是生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷（核酸）、硫、铁（细胞色素）、镁、钙（调节细胞膜透性）、锰、铜、锌（辅酶或激活剂）、钴、钾、钠（调节渗透压）、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。水水是所有培养基的主要组成成分，是生命活动不可或缺的物质，是细胞的主要成分，良好的介质，营养传递的道体，调节细胞生长。生长因子生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物质。在这种天然培养集中已然含有无需添加。前体物质在抗生素发酵过程中加入前提物可以控制菌体合成抗生素的方向和增加抗生素的产量。在螺旋霉素发酵中不同的前体物对发酵有不同的影响。本设计采用正丙醇作为前体。在20h补加0.5%正丙醇。消泡剂在发酵的过程中会有泡沫的出现，需要添加消泡剂进行消泡。本设计中含有的豆油，可作为消泡剂。灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中的一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌法，射线灭菌法，干热灭菌法，湿热灭菌法，过滤除菌法。为减少对培养基的破坏，采用湿热灭菌。培养基的湿热灭菌还分分为：培养基的分批灭菌和连续灭菌。分批灭菌设备简单，易操作，但是计算难，耗时长，对培养基的破坏比较大。连续灭菌在不同的温度下分开灭菌，减少了培养基受热破坏的程度，灭菌时间短，提高了设备的利用率。本设计采用湿热连续灭菌对培养基进行灭菌。连续灭菌的设备①配料预热罐，将配好的料液预热到60～70℃，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；②连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度；③维持罐，是一个直立圆形容器，附有进出料管道，保温时，培养基由进料口连续进入维持罐底部，液面不断上升，离开罐后流入冷却器。④喷淋冷却器，一般安装在室外，顶端装有带齿轮的水槽，冷却水从水槽内溢出沿下方的管壁以膜状依次流下。培养基从下部进入，从上部排出由分配站进入发酵罐。连续灭菌的流程图5-1-2连续灭菌的流程图培养基在采用连续灭菌时，发酵罐应该在连续灭菌前先进行空罐灭菌，通常先把发酵罐的空气过滤器灭菌并用空气吹干。加热器、维持罐及冷却设备也应先行灭菌。组成培养基的不同成分可以在不同的温度下分开进行灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到131℃（1）配料配料罐用于培养基的配置。然后将培养基用泵打入预热桶中。、（2）预热预热桶的作用一是定容，二是预热。预热的目的是使培养基在后续的加热过程中能快速的升到指定的灭菌温度，同时避免太多的冷凝水带入培养基，还可减少震动和噪声。一般可将培养基预热到70～90℃.（3）预热好的培养基由连消泵打入加热器。加热器也称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为0.45～0.8MPa，其目的是使培养基在较短时间（20～30s）里快速升温。加热器有塔式加热器和喷射加热器两种。（4）保温保温是将培养基维持灭菌温度一段时间，使杀灭微生物的主要过程。其设备有维持罐和管事罐两种。保温设备一般采用保温材料包裹，但不直接通入蒸汽。（5）降温升降温快是连续灭菌的主要特征之一，为避免培养基营养成分的破坏，保温后的培养基需要迅速降温至接近培养温度（40～50℃）.国内大多采数用喷淋冷却设备，也有采用螺旋板式换热器、板式换热器、真空冷却器等。反应根据培养基的特点、处理量、场地特性选用喷淋冷却设备。空罐灭菌方法：从有关管道通入蒸气，使罐内蒸气压力达0.147MPa，维持45min。灭菌过程从有关阀门，边阀排除空气，并使蒸气通过达到死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸气后，待管内压力低于空气过滤器时，通入无菌空气保压0.098MPa。空气中的微生物主要是细菌、酵母菌、霉菌和病毒，它们大多附着在空气中的灰尘上。空气的预处理图为空气净化系统流程图，把这一流程中过滤器以前的部分称为空气的预处理。图5-3-1空气除菌设备流程图采风塔：采风塔建在工厂的上风头，远离烟囱，采风塔可用灰铁皮或砼制成。采风塔越高越好，至少10m，气流速度为8m/s。粗过滤器：安装在空压机吸入口前，主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。应阻力小，容量大。空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。本设计采用往复式空压机。空气贮罐：作用是消除压缩空气的脉动，空气贮存，降温，保证稳定的出口压要求：H/B=2～2.5，V=（0.1～0.2）VA其中，H为罐高；B为罐直径；VA为空压机每分钟排气量（20℃，1×105Pa状况下），冷却器：空压机出口温度气温在120℃旋风分离器：是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。它结构简单、阻力小、分离效率高。丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对1μm以上的雾滴除去率98％。空气加热设备：压缩空气加热设备一般采用列管换热器，空气走管程，蒸汽走壳程，换热系数一般为160W/（m2·℃）。空气的过滤除菌大型的发酵工厂常采用两级或者三级过滤器，本设计采用两级过滤器，第一级过滤器称为总过滤器，二级为分过滤器。总过滤器：纤维及颗粒状介质过滤器，介质为玻璃纤维和活性炭颗粒。纤维层：活性炭层：纤维层高度为1：1：1——。分过滤器：微孔膜过滤器，它是由耐高温、疏水的、厚度为150μμm的微粒，能清除几乎所有空气中夹带的微生物。压缩空气总过滤器分过滤器无菌空气进发酵罐无菌空气的检验空气系统的无菌检测主要考察过滤器是否失效。过滤器失效的检测方法之一是检测过滤器两侧的压降，压降大说明过滤介质被堵塞；二是用粒子计数器测定空气中的粒子数是否超标，有无达到洁净度要求。6种子扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。图6种子制备的工艺流备图孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。本设计采用在pH=7、28℃下培养12d。种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子罐培养的目的是使种子量增大，以缩短发酵罐的发酵延滞期。将生产菌种悬浮液用微孔接种法接入种子罐进行扩大培养，种子罐之间的转接采用压差接种法，种子罐接入发酵罐也采用压差接种法。螺旋霉素的种子制备采用三级发酵。培养温度和时间均为28℃种子罐的衡算：二级种子罐：500××÷0.7=40m³，每个周期需要3个40m一级种子罐：40××÷0.7=6m³，每个周期需要3个6m（1）原材料质量的影响（2）培养条件温度：要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄，必须保证在最适范围，尽量控制在28℃湿度：其相对湿度应当保持在40%～50%之间。/分。（3）斜面冷藏时间：冷藏时间越长，越需要活化，冷藏时间不能超过7—8天。7发酵工艺流程控制微生物发酵过程可分为分批、补料-分批、半连续和连续等几种方式。由于在发酵过程中需要添加培养基，本设计采用补料-分批发酵。温度温度：是指发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。其高低与发酵中酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等有密切关系。影响发酵温度变化的因素：发酵热是发酵过程中释放出来的净热量，由产热因素和散热因素两方面决定的。Q发酵=Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q显－Q辐射7.2.2pH微生物生长和产物合成的最重要的状态参数是代谢活动的综合指标。PH对发酵的影响:①影响酶的活性。②影响微生物细胞膜所带电荷的状态。③影响培养基中某些组分中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；④pH不同，引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。⑤影响霉菌的形态。pH的控制:①发酵培养基的配方，有些成分可在中间补料时补充调控。②加入适量的缓冲剂，控制培养基pH的变化，采用内源调节。③在发酵过程加酸碱或其他物质进行调节。溶氧溶氧是微生物生长所必需的，是影响发酵的重要因素。溶氧太低会使糖代谢缓慢，菌体生长不良，产物合成受阻；溶氧太高则使菌体生长过于旺盛，底物完全氧化的比例过高，也不利于产物的合成。对溶氧的控制还应考虑底物的浓度，在不同的底物浓度下应有不同的溶氧水平，底物浓度较高时，增加DO可以加强菌体的代谢活性，不会因为基质的完全氧化降低产量；底物浓度较低时，过高的溶氧会导致基质的完全氧化而降低产物的产量。DO水平应该保持在50%以下。CO2溶解在发酵液中的CO2对发酵有抑制或刺激作用。大多数微生物适应低浓度CO2，当尾气CO2浓度高于4%时，微生物的糖代谢与呼吸速率下降。呼吸商RQ=CO2释放率/摄氧率，可以判断菌的生长、呼吸情况，还可以反映菌的代谢情况。泡沫对发酵的影响及控制泡沫对发酵的影响及其控制：通气搅拌和代谢产生的气体是泡沫产生的原因。泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系，泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。一类存在于发酵液的液面上，气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面液体之间有明显界线；另一种是出现在粘稠的发酵液中均匀而细的泡沫，比较稳定，其气相所占比例由下而上逐渐增加，气泡与液面没有明显界限，此类泡沫又称为流态型泡沫。泡沫控制方法包括物理消泡和化学消泡，在本设计中，豆油可作为消泡剂，进行消泡。接种量为8%，发酵周期为96小时，发酵温度28°C判断放罐的指标主要有菌体浓度、过滤速度、菌体形态、氨基氮、pH、DO和发酵液的黏度和外观等。一般，菌丝自溶前的迹象有：氨基氮、DO和pH开始上升，菌丝碎片增多，黏度增加，过滤速度下降。1.染菌原因：种子质量问题，培养及灭菌不彻底，空气染菌，泡沫冒顶，夹套、内壁破裂。处理方法：（1）前期染菌，重新灭菌，补充新鲜培养液；（2）中期染菌，检验所感染杂菌，偏离杂菌的生长条件；（3）发酵后期染菌，提前放罐。2.噬菌体感染：发酵液变稀，在通气量扥外部条件不变的情况下，DO迅速回升。处理方法：灭菌放罐，清除生产环境，调换生产菌株，停产整顿（极其严重情况下），选育抗性菌。8发酵罐的工艺设置年产300吨的螺旋霉素的工艺设计，螺旋霉素的发酵周期为4天，生产周期为5天。一年的工作日有200天。螺旋霉素的产率为/L，发酵液收率95%，发酵液预处理收率为95%，固液分离率为83%，提取率为92%，纯化时收率为82%，干燥的收率为95×××5×=0.56）0.56，装料系数0.7。产300吨螺旋霉素所需的发酵液量：300×103÷÷÷11.1=³÷（200÷5）=³本设计选用补料分批发酵，选取500m3每个发酵罐一个周期的共用发酵液量为：500××（1+12%+10%）=427m所以选用三个500m³（1）发酵罐的选择选用机械搅拌通风发酵罐(2)发酵罐设计发酵罐中，取H/D=2；取d/D=1/3；C/d=1；s/d=3；W/d=0.1；B=0.2W；封头高度：h=ha+hb,ha=1/4D。V全=πD2[H+2(hb+D/6)]/4,H=2D,hb忽略。V全=500m³，得D=,H=,d=,C=,s=,W=,B=.其中：H：发酵罐筒身高D：发酵罐内径d：搅拌器直径W：档板宽度C：下搅拌器距底部距离S：两搅拌器之间的距离Hl：液位高度B:挡板与罐壁距离9下游加工螺旋霉素发酵液的提取采用溶酶萃取法。螺旋霉素的提取步骤：发酵液发酵液净化液滤液水提液水洗液水提液脱溶液结晶液湿晶体干燥成品包装入库将发酵液加1.0%～1.5%的硫酸铝并调节pH值4.5～5.0，搅拌，静止，使蛋白质充分沉淀。过滤发酵液首先通过板框过滤机过滤。各板框机的进料压力相同，过滤压力最初不得超过0.03MPa，待每个出料嘴都出料后可以提高至0.05MPa，滤速减慢，至0.10～0.15MPa，整批过滤完后，用3.5～4.0m3/次的水顶洗，用30%（V/V）低单位（400U/mL以下）酸水顶洗。接着过滤液由水输送至滤液贮池，滤液再通过泵送至混合萃取罐。9.3醋酸丁酯提取用5moL/LNaOH调过滤液pH值8.5～9.0，将醋酸丁酯泵入混合萃取罐。启动搅拌机搅拌（80～100r/min）混合后静置分层。若干小时后，如出现乳化层，则用高速离心机将丁酯相和水相分开。9.4水洗丁酯提取液由萃取罐泵送到水洗罐。然后用40℃9.5水提水洗后再泵入水提灌。按水提液为30000～50000U/mL计算无盐水。用量：用1moL/L氯化氢和0.05mmoL/L磷酸二氢钠缓冲液调pH值为2.0～2.5，与丁酯提取液混合搅拌1min，重复3次，静置分层40～60min，分2次提取，合并2次水液，用真空泵抽到脱溶罐。9.6脱丁酯水提液通过真空泵缓缓输入脱丁酯罐。用1moL/L氢氧化钠回调pH值5.0～5.5，加碱液要慢，防止局部结膜，用0.02MPa干净空气和真空彻底去除，至无丁酯味为止，防止跑料。9.7结晶晶体成核可分为初级成核（没有待结晶物质以晶体形式存在）和二次成核（已有待结晶的物质以晶体形式存在）两类。螺旋霉素晶核大小测量困难，因为结晶过程中成核和晶体生长总是相耦合的，并且没有合适的条件可以保存它。光散射提供了一种估计核大小