免疫细胞功能检测

T细胞数量及功能检测免疫学检验技术—*—

T细胞数量及功能检测T细胞数量检测（1）间接荧光免疫法如：抗CD3+PBMC→荧光素标记的二抗→荧光显微镜计数荧光染色阳性细胞/流式细胞术检测（2）免疫组织化学法

1）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）技术

2）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）技术

3）免疫金银染色（IGSS）技术—*—

T细胞数量及功能检测T细胞数量检测1）ABC法如：反应形成T细胞表面CD3-抗CD3-生物素化的二抗-ABC复合物，酶催化底物使T细胞着色，计数着色细胞数。BAEBBBEEEBBBEAAEBBEBABBB—*—

T细胞数量及功能检测T细胞数量检测2）APAAP法反应形成T细胞表面CD3/CD4/CD8-抗CD3/CD4/CD8-IgG类二抗-APAAP复合物，酶催化底物使T细胞着色，计数着色细胞数。AP—*—

T细胞数量及功能检测T细胞数量检测3）IGSS法胶体金标记抗CD3/CD4/CD8（一抗，直接法）或二抗（间接法）与T细胞反应，加入银显色液，银离子被还原成银原子，围绕金颗粒形成银壳，显微镜计数阳性细胞。AuAu—*—

T细胞数量及功能检测T细胞功能检测(1）T细胞增殖试验T细胞在体外受丝裂原或抗原刺激后，可向淋巴母细胞转化，用于体外的刺激物有植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）、美洲商陆（PWM）、白喉类毒素、破伤风类毒素等。检测T细胞增殖状况的常用方法：1）形态学检查法；2）3H-TdR掺入法、3）MTT比色法。—*—

T细胞数量及功能检测T细胞功能检测(2）T细胞介导的细胞毒试验淋巴细胞介导的细胞毒作用是细胞毒性T细胞的特性。CTL经抗原刺激后，再次遇到具有相应抗原的靶细胞时可特异性杀伤靶细胞，导致靶细胞溶解、破坏。一般采用51Cr释放法检测CTL的细胞毒作用。—*—

T细胞数量及功能检测T细胞功能检测(3）MHC-抗原肽四聚体技术1个荧光素标记的亲和素与4个生物素标记的MHCⅠ类分子-抗原肽四聚体结合，此四聚体能同时结合1个抗原特异性T细胞上的4个TCR，亲和力显著提高。可通过流式细胞仪定量检测样品中抗原特异性T细胞数量及所占比例。—*—

T细胞数量及功能检测T细胞功能检测（4）淋巴细胞内细胞因子检测流式细胞术时是普遍采用的检测细胞内细胞因子的方法。（5）体内试验常用的皮肤试验包括结核菌素试验和PHA皮肤试验。B细胞数量及功能检测免疫学检验技术—*—

B细胞数量及功能检测B细胞数量和功能检测总思路B细胞数量检测：主要基于B细胞表面存在膜免疫球蛋白（MIg）、CD分子、小鼠红细胞受体等重要标志。B细胞功能试验：检测B细胞在特异性抗原作用下的细胞增殖能力和分泌某种抗体的能力。必要时可采用溶血空斑试验、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）。—*—

B细胞数量及功能检测B细胞数量检测（1）MIg的检测MIg是B细胞特有的表面标志可用于鉴定B细胞。正常人外周血中MIg+细胞一般为8%-12%。（2）CD分子的检测B细胞表面具有CD19、CD20、CD21、CD22、CD29以及CD5等分化抗原，正常人外周血中CD20+细胞约占淋巴细胞总数的8%-12%。（3）小鼠红细胞受体的检测部分B细胞能与小鼠红细胞形成花环，健康人为5%-10%。—*—

B细胞数量及功能检测B细胞功能检测（1）B细胞增殖试验人B细胞采用含SPA的金葡或抗IgM抗体为刺激物。（2）经典溶血空斑试验用于检测实验动物B细胞抗体产生能力的方法。（3）酶联免疫斑点试验（ELISPOT）可在单细胞水平上检测抗体生成细胞及其抗体产生量。NK细胞数量及功能检测免疫学检验技术—*—

NK细胞数量及功能检测NK细胞数量及功能检测（1）NK细胞数量检测NK细胞主要根据CD3、CD56和CD16等细胞表面标志进行数量测定。（2）NK细胞功能检测

1）形态学法

2）酶释法

3）荧光法

4）放射性核素释放法

5）流式细胞术吞噬细胞功能检测免疫学检验技术—*—

吞噬细胞功能检测吞噬细胞概述种类：（1）大吞噬细胞→单核吞噬细胞系统（血液:单核细胞+组织器官:巨噬细胞）1）单核细胞分离方法:Percoll密度梯度分离法/流式细胞术分离法/免疫磁珠分离法（M特异性表达CD14）/黏附法。

2）巨噬细胞分离方法：斑蝥敷贴法。（2）小吞噬细胞→中性粒细胞

6%右旋糖酐与一定抗凝血混合后静置，取上层细胞。—*—

吞噬细胞功能检测中性粒细胞（N）功能检测中性粒细胞功能：趋化、吞噬和杀伤。1、趋化功能检测

（1）体内试验法（皮肤窗法）受检者前臂曲侧中央3mm范围内搔刮皮肤，盖玻片压紧固定，于2、5、8、12、24、36h各取样一次，染色观察N。健康者一般2-3小时后开始聚集，达50-100个，6小时可达1000个以上。—*—

吞噬细胞功能检测中性粒细胞（N）功能检测（1）体外试验法1）滤膜渗透法（Boyden小室法）采用分上下层的微孔趋化小室，趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，37℃孵育数小时后，上室的N受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、染色后，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离。—*—

吞噬细胞功能检测中性粒细胞（N）功能检测

2）琼脂糖平板法在琼脂糖凝胶平板上打孔（左、中、右三孔），孔径3mm，孔间距2-3mm，左孔加趋化因子，中间孔加白细胞悬液，右孔加对照液，37℃，4-8h进行固定和染色，用测微器测定N向左孔的移动距离A，向右孔的移动距离B，两者比值（A/B）为趋化指数，趋化指数越大，N运动功能越强。—*—

吞噬细胞功能检测中性粒细胞（N）功能检测

2、吞噬功能检测方法：显微镜法基本过程：白细胞悬液与金黄色葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合，37℃孵育后涂片、固定和染色。油镜下计数100个细胞中吞噬和未吞噬细菌的N数，并记录吞噬的细菌数。—*—

吞噬细胞功能检测中性粒细胞（N）功能检测

3、杀伤功能检测1）溶菌法2）硝基蓝四氮唑（NBT