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文档简介

病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术荧光与荧光素免疫荧光组织化学技术

荧光与荧光素

在免疫荧光技术中,荧光显微镜电光源发出激发光,将标记在抗体上的荧光素激发出荧光,通过荧光显微镜观察荧光图像。

荧光与荧光素

一、荧光在一定波长的光如紫外光等照射后,某些物质吸收照射光后被激发出的比照射光波长更长的可见光,称为荧光(fluorescence)。荧光寿命很短,一般约为10-9~10-8秒,所以当紫外光停止照射后荧光便马上消失,但这种消失并非为荧光淬灭现象。荧光与荧光素

一、荧光荧光淬灭是指标记了抗体的荧光素或与组织细胞结合的荧光染料,在染色过程中与各种试剂的作用,长时间保存尤其是在高温环境或经过长时间紫外光照射后,使荧光素被激发出荧光的能力减弱,甚至消失。因此,免疫荧光染色结果难以长时间保存。荧光与荧光素

荧光可分为以下两种:（一）诱发荧光一些物质本身不能发出荧光，但经过标记荧光素或经荧光染料染色后,经过紫外光照射激发荧光素或经荧光染料发出的荧光称为诱发荧光。经免疫荧光染色后观察到的组织细胞中的荧光属于诱发荧光。（二）自发荧光一些物质如血红蛋白等本身在紫外光照射后,能发出荧光,这种荧光称为自发荧光。自发荧光相对较弱,但也是造成免疫荧光非特异性染色的原因之一。二、激发光激发光是由荧光显微镜光源发出,激发引起荧光最有效的是波长较短的紧外光和蓝紫光,而荧光的亮度与光源发出的激发光强度成正比。因此,荧光显微镜所用的激发光源要求强度大,常用高压汞弧灯或高压氙弧灯为激发光源,用激光作为激发光源,可获得更加明亮的荧光,如使FITC发出的荧光比汞弧灯强上百倍。荧光与荧光素

三、荧光素

能吸收一定波长的光(如紫外光)的照射光后,被激发出可见光的物质称为荧光素(fluorescein)。许多物质都能产生荧光,但在免疫荧光技术可用做荧光素的物质需要满足以下要求:1.性质稳定,安全无毒性。2.能与抗体蛋白牢固结合。3.标记抗体后不影响抗体的活性。4.标记抗体简单,方便。5.被激发出的荧光鲜艳,明亮。6.标记抗体后,荧光淬灭缓慢。荧光与荧光素

用于标记抗体的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、四乙基罗丹明(RB200)和某些镧系螯合物(如3价稀上镧系元素铕和铽)等,常用的有以下两种：1.异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)能与各种抗原蛋白结合,不影响结合后的抗体与抗原结合的特异性。被波长为490~495nm的激发光激发,发出的荧光呈明亮的黄绿色,由于人眼观察黄绿色较敏感、舒适,所以是最常用的荧光素。荧光与荧光素

2.四甲基异硫氰酸罗丹明B(tetramethylrhodamineBisothiocyanate,TRITC)为荧光染料,也用于标记

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