马铃薯茎尖组织培养脱毒技术

种子生产与经营专业教学资源库《薯类种子生产技术》马铃薯茎尖组织培养脱毒技术目录CONTENTS一二三茎尖分生组织培养脱毒热处理结合茎尖培养脱毒脱毒苗鉴定一、茎尖分生组织培养脱毒（一）培养基制备培养基是人工配制的，满足植物材料生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。1.培养基配制（1）培养基配方MS+GA­30.2～0.3mg/L+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.05mg/L+泛酸钙1.5～2.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6～7g/L，pH5.8，分装入管(或瓶)。（2）配制方法一般，先配制母液，再配制培养基。（一）培养基制备1.培养基配制（2）配制方法母液是培养基各种物质按原来浓度扩大一定倍数的浓缩液，也称贮备液。通常扩大10倍、100倍等。①配制母液操作流程：计算→称量→溶解→定容→标记→保存组成MS培养基配方的19种化合物配制成的4种母液（一）培养基制备1.培养基配制（2）配制方法②配制培养基操作流程：确定配方、配制量→计算→称量→溶解→定容→测调pH→分装→封口→标记4种母液培养基（一）培养基制备2.培养基灭菌在0.105Mpa／cm2压力下灭菌15～20min，冷却备用。一、茎尖分生组织培养脱毒（二）外植体选取与消毒组织培养中，用于培养的植物胚胎、器官、组织、细胞以及原生质体统称为外植体。1.外植体选取应选用生产上主栽的、或具有某种特性(如抗马铃薯癌肿病)优良品种块茎的休眠芽或刚出土幼苗的茎尖、或田间成株上的叶芽作茎尖剥离材料。（二）外植体选取与消毒2.外植体消毒将入选材料放入纱布袋，用自来水冲洗1h后，在无菌条件下，放入70％～75％酒精中浸5～30s，再用无菌水漂洗1～2次，再用0.1％升汞（每升加1滴吐温）液消毒3～8min(或用3％次氯酸钠液加2～4滴吐温振荡消毒15～20min)，取出用无菌水漂洗3～5次，沥干备用。一、茎尖分生组织培养脱毒（三）茎尖剥离与接种用灭菌滤纸吸干材料表面水分，在体视解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶，切取带1～2个叶原基(0.1～0.4mm大小)的生长点，迅速接入装有茎尖分化培养基的试管或培养瓶中，每管（瓶）放1个生长点。注明品种，茎尖号，接种期。一、茎尖分生组织培养脱毒（四）茎尖培养日温25℃，夜温15℃，光照时数12～14h／d，光照强度2000～3000lx条件下培养。二、热处理结合茎尖培养脱毒热处理：50℃左右温水浸泡处理几十分钟或35～40℃热空气中培养2～4周或更长时间。三、脱毒苗鉴定马铃薯PLRV、PVY、PVA、PVX、PVM或PVS等病毒，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测，无阳性反应再用指示植物鉴定。纺锤块茎类病毒(PSTVd)用往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法（R）检测，鉴定筛选出不带PLRV、PVY、PVA、PVX、PVM、PVS和PSTVd的脱毒苗。经鉴定脱毒苗可以进行继代增殖培养。ELISA双抗体夹心测抗原（病毒）病毒种类指示植物表现症状马铃薯X病毒（PVX）千日红、曼陀罗、辣椒、心叶烟脉间花叶马铃薯S病毒（PVS）苋色藜、千日红、曼陀罗、昆诺阿藜叶脉深陷，粗缩马铃薯Y病毒（PVY）野生马铃薯、洋酸菜、曼陀罗随品种而异，有些轻微花叶或粗缩，敏感品种反应为坏死马铃薯卷叶病毒（PLRV）洋酸菜叶尖呈浅黄色，有些