动物细胞工程优选ppt资料

动物细胞工程(gōngchéng)第一页，共72页。细胞工程植物(zhíwù)细胞工程动物细胞工程(gōngchéng)植物(zhíwù)组织培养植物体细胞杂交第二页，共72页。小资料(zīliào)：1978年，我国生物学家从出生不久的小鼠的心脏取下细胞，进行离体培养，成功地使心肌细胞在离体培养条件下连续搏动100多天。他们(tāmen)利用培养的心肌细胞进行了形态学、搏动功能及药物反应的研究。第三页，共72页。动物细胞工程动物(dòngwù)细胞培养动物(dòngwù)细胞融合单克隆抗体核移植动物细胞工程(gōngchéng)技术手段：动物细胞工程的技术基础第四页，共72页。1、动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境培养液和所有培养用具(yòngjù)进行无菌处理！营养葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子（维生素、激素等）和动物血清温度和PH气体环境95％空气5％的CO2一、动物(dòngwù)细胞培养第五页，共72页。凝固血清红细胞、白细胞、血小板、凝血因子等血清(xuèqīng)：含有水分、蛋白质、氨基酸、葡萄糖及各种激素等，与组织液成分相似血浆(xuèjiāng)第六页，共72页。2、过程动物胚胎(pēitāi)或幼龄动物的组织、器官剪碎胰蛋白酶(yídànbáiméi)（分解弹性(tánxìng)纤维、胶原蛋白）1－10代细胞原代培养40-50代细胞无限传代细胞悬浮液传代培养少数细胞少数细胞不死性遗传物质改变遗传物质未改变第七页，共72页。第五十九页，共72页。1978年，我国生物学家从出生不久的小鼠的心脏取下细胞，进行离体培养，成功地使心肌细胞在离体培养条件下连续搏动100多天。第四十九页，共72页。血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。第二十七页，共72页。三、单克隆抗体(kàngtǐ)2个或多个细胞融合成一个(yīɡè)细胞的过程抗原(kàngyuán)与抗体D、可以在生物体内生产，不能体外生产D、可以在生物体内生产，不能体外生产2、（06浙江）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织(zǔzhī)培养基有何独特之处？植物细胞和动物细胞培养的比较细胞融合过程中两个(liǎnɡɡè)细胞膜的变化物理（离心、振荡、电刺激）（1）为什么动物(dòngwù)组织细胞要用胰蛋白酶处理？细胞(xìbāo)贴壁过程第八页，共72页。小资料(zīliào)：1951年，美国一位黑人妇女HenriettaLacks因宫颈癌去世，其宫颈癌上皮细胞在体外连续培养，形成(xíngchéng)肿瘤细胞系，这就是至今仍在世界各国广为应用的HeLa细胞系。第九页，共72页。动物细胞培养过程(guòchéng)的两个现象细胞贴壁：悬液中分散的细胞贴附在瓶壁上生长。接触(jiēchù)抑制：动物细胞进行有丝分裂，数量不断增多，当贴壁细胞生长到表面相互接触(jiēchù)时，细胞就会停止分裂增殖。第十页，共72页。两个(liǎnɡɡè)概念：原代培养：从生物体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代与10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制(pèizhì)成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。第十一页，共72页。相关概念：细胞株：原代细胞一般传至10代左右(zuǒyòu)细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去(shīqù)接触抑制，容易传代培养。第十二页，共72页。3、动物(dòngwù)细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的大规模生产如病毒疫苗、干扰素、抗体等检测有毒物质细胞的生理(shēnglǐ)、药理、病理研究第十三页，共72页。3、动物细胞培养技术(jìshù)的应用健康细胞培养如培养健康细胞用于烧伤病人(bìngrén)皮肤移植培养表皮干细胞第十四页，共72页。ESC典型的不对称分裂,具慢周期性和高增殖性.ESC的标记蛋白是角蛋白K19.组织工程皮肤是一个极热门的话题.如体外培养表皮和真皮,用以修补(xiūbǔ)皮肤损伤.表皮(biǎopí)干细胞.ESC第十五页，共72页。人耳小白鼠第十六页，共72页。组织(zǔzhī)工程鼻软骨第十七页，共72页。组织工程(gōngchéng)耳软骨第十八页，共72页。获得(huòdé)细胞细胞(xìbāo)的全能性动物细胞植物体培养(péiyǎng)结果或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清等蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较第十九页，共72页。二、动物(dòngwù)细胞融合动物细胞融合是正常的生命(shēngmìng)活动2个或多个细胞融合成一个(yīɡè)细胞的过程精子第二十页，共72页。1、诱导(yòudǎo)方式物理法:离心、振动(zhèndòng)、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）生物(shēngwù)法：灭活的病毒仙台病毒紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）二、动物细胞融合第二十一页，共72页。细胞融合过程中两个(liǎnɡɡè)细胞膜的变化第二十二页，共72页。具有不同DNA的两个(liǎnɡɡè)细胞灭活病毒诱导细胞融合（先质后核）融合后的杂交细胞进行有丝分裂2.过程(guòchéng)：第二十三页，共72页。形成(xíngchéng)杂交细胞获得(huòdé)杂种植株结果(jiēguǒ)物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法细胞增殖、细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较融合前处理纤维素酶、果胶酶去壁胰蛋白酶使细胞分散第二十四页，共72页。动物(dòngwù)细胞融合：基因型相同或不同的动物细胞之间进行融合；细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能，特别(tèbié)是杂交瘤技术，实现了单克隆抗体的制备。第二十五页，共72页。单克隆:经过克隆(kèlónɡ)的细胞群，来源于单个细胞，称为单克隆(kèlónɡ)或纯系。三、单克隆抗体(kàngtǐ)第二十六页，共72页。单克隆:单个细胞(xìbāo)经过克隆形成的细胞(xìbāo)群，称为单克隆或纯系。三、单克隆抗体(kàngtǐ)第二十七页，共72页。抗原(kàngyuán)与抗体抗原：一般指进入人体的外来物质，如细菌、病毒、花粉或一些大分子蛋白质等，具有特异性。抗体：机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合(jiéhé)的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体，主要分布在血清中。第二十八页，共72页。抗体(kàngtǐ)是怎样产生的？问题(wèntí)1个B淋巴细胞→1种特异性抗体(kàngtǐ)第二十九页，共72页。B淋巴细胞与抗体(kàngtǐ)B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体；每一个B淋巴细胞只能合成并分泌一种(yīzhǒnɡ)特异性抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用；抗血清中的抗体种类多，成分不单一。第三十页，共72页。如何(rúhé)大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生(chǎnshēng)抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞第三十一页，共72页。抗体(kàngtǐ)抗原(kàngyuán)动物体刺激效应B筛选单一效应B细胞B细胞体外不能无限增殖产量低、纯度(chúndù)低反应不够灵敏传统获得抗体的方法：第三十二页，共72页。设计方案：一个B淋巴细胞——只分泌一种特异性抗体(kàngtǐ)小鼠骨髓瘤细胞——能无限增殖杂种细胞如何获得(huòdé)大量的、化学性质单一的抗体？第三十三页，共72页。B淋巴细胞第三十四页，共72页。单克隆抗体(kàngtǐ)制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选(shāixuǎn)杂交瘤细胞（多种）细胞培养筛选，继续培养产生特定(tèdìng)抗体的杂交瘤细胞单克隆体外培养注射到小鼠腹腔单克隆

抗体第三十五页，共72页。第一次筛选(shāixuǎn)：杂交瘤细胞第二次筛选(shāixuǎn)：产生需要的特异抗体的杂交瘤细胞第三十六页，共72页。杂交瘤细胞(xìbāo)1杂交瘤细胞(xìbāo)2杂交瘤细胞(xìbāo)3Mab1Mab2Mab3抗原第三十七页，共72页。思考(sīkǎo)：1、单抗的制备(zhìbèi)利用了哪些原理？免疫原理(yuánlǐ)，细胞融合原理(yuánlǐ)和动物细胞培养原理(yuánlǐ)2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体第三十八页，共72页。单克隆抗体(kàngtǐ)的应用优点：特异性强，灵敏度高，能大量(dàliàng)制备1、作为诊断试剂图片：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。第三十九页，共72页。2、用于治疗疾病和运载药物作为载体，运载抗癌药物，形成(xíngchéng)“生物导弹”治疗肿瘤癌细胞单抗抗癌药物第四十页，共72页。练习1：关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是A、可以制成诊断盒．用于疾病的诊断B、可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗(zhìliáo)C、制备过程中要经过两次筛选D、可以在生物体内生产，不能体外生产D第四十一页，共72页。2、（06浙江）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是A．培养中的效应T细胞能产生单克隆抗体B．培养中的B细胞能够无限地增殖C．人的成熟红细胞经过培养能形成(xíngchéng)细胞株D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞D第四十二页，共72页。单克隆抗体(kàngtǐ)的概念单:单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质(huàxuéxìngzhì)单一、特异性强单克隆抗体：指单个杂交瘤细胞无性繁殖（克隆）形成的细胞系产生的抗体。单克隆抗体的优点(yōudiǎn)特异性强、灵敏度高、能大量制备第四十三页，共72页。四、动物(dòngwù)核移植将动物体细胞的细胞核，移入另一个去核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎(pēitāi)，并最终发育成为动物个体。第四十四页，共72页。为什么进行(jìnxíng)核移植？动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而受到限制，分化潜能逐渐变弱，但动物细胞核具有(jùyǒu)全能性克隆动物，实际是通过核移植技术实现的。植物体离体植物细胞离体动物细胞动物细胞第四十五页，共72页。出生近两周的克隆兔与同日(tónɡrì)出生的普通兔相比，体形上要大许多。胚胎细胞克隆(kèlónɡ)兔中国1990年克隆(kèlónɡ)兔普通兔第四十六页，共72页。胚胎(pēitāi)细胞克隆山羊中国1990第四十七页，共72页。多利英国(yīnɡɡuó)1997年第四十八页，共72页。1990年中科院发育生物研究所杜淼获得了克隆兔，随后中国相继成功克隆了克隆羊、克隆猪、克隆牛、克隆鼠等；1997年，克隆羊多利诞生，克隆技术名扬世界。多利是世界上第一(dìyī)只用体细胞克隆的动物，在此之前的所有克隆动物，供体细胞都是胚胎细胞。第四十九页，共72页。动物细胞的全能性全能性：细胞(xìbāo)发育成完整个体的潜能受精卵＞胚胎干细胞(xìbāo)（多能干细胞(xìbāo)）＞单能干细胞(xìbāo)＞体细胞(xìbāo)第五十页，共72页。胚胎(pēitāi)细胞核移植：核供体细胞是胚胎(pēitāi)细胞。体细胞核移植：核供体细胞来高度分化的体细胞。体细胞核移植的难度(nádù)远高于胚胎细胞核移植。第五十一页，共72页。体细胞核移植的过程（以高产(ɡāochǎn)奶牛为例）体细胞培养(péiyǎng)取出核甲牛乙牛MⅡ卵母细胞去除(qùchú)核去核次级卵母细胞重组卵细胞核植入卵裂早期胚胎代孕母牛丙移植体细胞群克隆牛细胞核移植胚胎移植物理或化学方法激活第五十二页，共72页。1、用于核移植的供体细胞一般(yībān)都选用传代10代以内的细胞，为什么？培养的动物细胞一般传代至10～50代左右时，部分细胞的遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持(bǎochí)正常的二倍体核型。讨论：第五十三页，共72页。2、用体细胞核移植法生产(shēngchǎn)的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆动物绝大部分DNA来自(láizì)于供体细胞核，但线粒体中的DNA是来自(láizì)于受体卵母细胞。此外，动物的一些行为、习性与环境有很大关系，核供体动物与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。第五十四页，共72页。1、保护(bǎohù)濒危物种细胞核去核卵母细胞核移植重组(zhònɡzǔ)胚胎核移植技术(jìshù)的应用第五十五页，共72页。2.人的核移植胚胎干细胞经诱导(yòudǎo)分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。第五十六页，共72页。小资料：核移植技术(jìshù)去核方法普遍使用显微操作去核法。还有梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理等。这些方法是在没有刺破透明带或卵母细胞质膜的情况下，去除细胞核或使卵母细胞核DNA变性，达到去核的目的。尽管核移植技术已经(yǐjing)在许多动物中获得成功，但其成功率仍然很低，产下的活克隆动物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%。克隆技术的各个环节还有待进一步改进。第五十七页，共72页。归纳(guīnà)总结：克隆技术及种类个体(gètǐ)水平克隆：核移植技术；植物组培分子水平克隆(kèlónɡ)：PCR技术（DNA复制，RNA复制）细胞水平克隆：动物细胞培养；植物愈伤组织的增殖第五十八页，共72页。分子水平克隆（PCR技术）：DNA的复制(fùzhì)；RNA的复制(fùzhì)；同一基因的多次表达等。细胞水平(shuǐpíng)克隆：动物细胞培养（单克隆抗体）；愈伤组织的不断增殖等。个体(gètǐ)水平克隆：克隆羊多利。第五十九页，共72页。动物细胞工程(gōngchéng)小结：两个(liǎnɡɡè)过程动物(dòngwù)细胞培养单克隆抗体制备三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势第六十页，共72页。动物细胞进行培养时通常要添加(tiānjiā)血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此(yīncǐ)，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。第六十一页，共72页。关于(guānyú)B淋巴细胞与老鼠骨髓瘤细胞融合的问题目前，动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体，但不能理解为用书中介绍的例子(lìzi)——B淋巴细胞与老鼠骨髓瘤细胞融合，已经能够生产人类的单克隆抗体。由于单克隆抗体上仍带有鼠的抗原决定簇，患者仍然有可能产生针对于单克隆抗体的抗体，因此交叉反应产生免疫反应及过敏反应这一问题仍未得到解决。因此现在的目标是获得高药效低免疫性的人类单克隆抗体。第六十二页，共72页。人的单克隆抗体生产存在(cúnzài)许多问题：①致敏问题人们努力寻求的抗体(kàngtǐ)往往是针对有毒抗原的，无法直接用这样的抗原去刺激某人体，并试图获得相应的B淋巴细胞。②杂交瘤细胞不稳定目前世界上已建立一些人骨髓瘤细胞株，它们和人的淋巴细胞融合后也能产生抗体(kàngtǐ)，然而未能获得像小鼠骨髓瘤系那样理想的株系。产生的杂交瘤细胞存在也不够稳定，抗体(kàngtǐ)效价也不够理想。③抗体(kàngtǐ)的生产问题已建株的细胞在体外培养较困难，若能在体内培养则较容易，这对于动物可以，然而用人的腹腔液培养就不可能。④转化细胞不稳定用病毒转化B淋巴细胞细胞也可建立细胞株系，但传代后只有小部分细胞分泌特异抗体(kàngtǐ)，且细胞随传代递减，很难建立起长期稳定的细胞株。人—鼠细胞杂交也可以，但随着细胞的分裂，人的染色体会大量丢失。第六十三页，共72页。杂交瘤细胞(xìbāo)的筛选：使用选择培养基---HAT培养基，此培养基中含有次黄嘌呤（Hypoxathine）、氨基喋呤（Aminopterin）、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)。在HAT培养基中，小鼠瘤细胞死亡，而杂交瘤细胞能继续(jìxù)繁殖。第六十四页，共72页。原代培养(péiyǎng)传代培养第六十五页，共72页。问题(wèntí)引导“怎样获得动物的细胞？”“培养基是用液体的还是固体的培养基？”“培养基中想放哪些营养物质？”“培养动物细胞时放在什么样的温度下，对培养液的PH值有什么要求？怎样解决细胞呼吸问题？”“培养瓶内营养物质不足、细胞产生的代谢废物多了怎么办？”“怎样防止(fángzhǐ)培养液当中混入细胞菌或病毒？”第六十六页，共72页。思考：2、为什么选用动物胚胎(pēitāi)或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织(zǔzhī)培养基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散(fēnsàn)成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体第六十七页，共72页。动物细胞的培养(péiyǎng)过程幼龄(yòulínɡ)动物取动物器官(qìguān)和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础第六十八页，共72页。资料：生物体的寿命和细胞传代(chuándài)的次数的关系1961年Hayflick和Moorhead报告说，培养的人二倍体细胞表现出明显的衰老、退化和死亡的过程。若以1：2的比率连续进行