酶类-胆碱酯酶

病理检验技术

特殊染色

酶类胆碱酯酶胆碱酯酶

胆碱酯酶(cholinesterase)属特异性酯酶,可分两大类。一类为乙酰胆碱酯酶(简称AChE),又称真性胆碱酯酶；另一类为胆碱酯酶,又称假性胆碱酯酶(简称PsChE)。胆碱酯酶属神经系统中的羧基酯酶,乙酰胆碱酯酶能水解乙酰胆碱；假性胆碱酯酶能水解胆碱的酯,而不是水解乙酰胆碱酯。乙酰胆碱是由胆碱能神经释放出的一种神经介质,正常的神经冲动常引起乙酰胆碱过量积聚,而乙酰胆碱酯酶则起生理的调节作用。胆碱酯酶

乙酰胆碱酯酶主要存在于神经元的胞质内、神经与肌肉接头处即所谓运动终板处;胆碱酯酶主要存在于血浆、胰腺和唾液腺内,其生理功能尚不明确。两者的化学性质很不相同,胆碱酯酶常用的抑制剂是10-5mol/L毒扁豆碱(eserine),它可抑制乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶,而每10ml孵育液中加入0.2m1的0.004mol/L四异丙基焦磷酰胺可抑制胆碱酯酶而不抑制乙酰胆碱酯酶,是一种较理想的胆碱酯酶抑制剂。显示乙酰胆碱酯酶的方法有多种,如Koell法,Snel和Garrett法、Gerebtzoff改良的Snell和Garrett法,Kamovsky和Roots法等,但后两种方法较为可靠,特别是Janovsky和Roots的亚铁氰化铜法,虽然其底物对组织的渗透性较差,但操作简便,酶的扩散又少,是一种较好的方法。胆碱酯酶

亚铁氰化铜法(根据Karnovsky和Roots)(一)试剂配制1.0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.5)2.0.lmol/L柠檬酸钠3.0.03mol/L硫酸铜4.0.005mol/L铁氰化钾5.0.004mol/L四异丙基焦磷酰胺6.孵育液7.Mayer苏木精液胆碱酯酶

(二)染色步骤1.新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟。置于冷10%的甲醛钙中固定10分钟,蒸馏水洗3次,每次1分钟。2.切片浸入预温的孵育液于37℃孵育1~2小时,至切片呈淡棕色时取出,蒸馏水洗后于镜下观察,如阳性产物颜色仍较淡,可于蒸馏水洗后再进行孵育,至反应合适为止。3.流水冲洗5分钟。4.Mayer苏木精染胞核3分钟。5.流水冲洗10分钟。6.常规脱水透明,中性树胶封固。胆碱酯酶（亚铁氰化铜法(根据Karnovsky和Roots)）

(三)结果乙酰胆碱酯酶活性部位呈红棕色至深粽色,细胞核蓝色。(四)对照方法在孵育液内加入10-5mol/L的毒扁豆碱,可同时抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱酯酶的(ChE)活性。胆碱酯酶（亚铁氰化铜法(根据Karnovsky和Roots)）

图亚铁氰化铜法结肠黏膜，乙酰胆碱酯酶活性部位呈红棕色

(五)注意事项1.配好后的孵育液应为澄清透明的淡绿色,如出现混浊则应重配。2.在配制孵育液时,各试剂称量要准确,过多或过少对结果都有影响。3.本法各种试剂加入的顺序是重要的,特别是硫酸铜,只能跟在柠檬酸钠后加入,否则会降低孵育液内铜离子的浓度。4.如要显示假性胆碱酯酶,可用碘化丁酰硫代胆碱6mg代替碘化乙酰硫代胆碱5mg作为底物配制孵育液,并省去四异丙基焦磷酰胺。5.假性胆碱酯酶抑制剂四异丙基焦磷酰胺配成0.004molL溶液放冰箱保存,其他试剂如0.1mol/L醋酸盐缓冲液,0.1mol/L柠檬酸钠,0.030mol/L硫酸铜均密塞放4C的冰箱可保存约半年,0.005mol/L铁氰化钾放4℃的冰箱可保存约2~3个月。胆碱酯酶（亚铁氰化铜法(根据Karnovsky和Roots)）

(六)染色机制乙酸胆碱酯酶水解碘化乙酰硫代胆碱,释放出硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱中的硫氢基（-SH）把铁氯化钾还原为亚铁氰化钾,后者与铜离子结合形成不溶性的红粽色至深棕色的亚铁氰化铜沉淀在酶活性部位而显示出来。胆碱酯酶（亚铁氰化铜法(根据Karnovsky和Roots)）

(七)应用在中枢神经和周围神经纤维都有乙酰胆碱酯酶的存在,因此,可利用乙酰胆碱酯酶染色观察该酶在疾病时的改变,有助于巨结肠症(Hirschspr