实验二叶绿体的分离与荧光观察

关于实验二叶绿体的分离与荧光观察第1页，课件共23页，创作于2023年2月实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。第2页，课件共23页，创作于2023年2月实验原理细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离在等渗溶液中进行组织匀浆、分离叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生/诱发荧光）第3页，课件共23页，创作于2023年2月常用的细胞破碎方法方法技术

原理效果成本举例机械法匀浆法细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎适中适中动植物组织或细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜植物组织超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎剧烈昂贵细胞悬浮液小规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞大规模处理化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎温和昂贵动植物细胞增溶法表面活性剂溶解细胞膜温和适中破碎大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁溶解剧烈便宜破碎大肠杆菌第4页，课件共23页，创作于2023年2月离心分离技术离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心密度梯度离心速率-区带梯度离心等密度离心第5页，课件共23页，创作于2023年2月差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取第6页，课件共23页，创作于2023年2月密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。第7页，课件共23页，创作于2023年2月速率-区带梯度离心和等密度梯度离心原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。A、速率-区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图原理：根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着浮力密度差，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。第8页，课件共23页，创作于2023年2月两种密度梯度离心方法的异同

特点速率-区带梯度离心等密度离心分离方法的主要依据主要依赖分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的

介质密度梯度选择最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒分辨率范围沉降系数相差～20%的物质颗粒密度差异大于1%离心后区带形成位置易变(样品易扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因素离心时间（过长或过短都不利）颗粒样品密度一般操作方法介质梯度应预先形成，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心后形成区带。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质蔗糖、甘油蔗糖、甘油、CsCl、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。第9页，课件共23页，创作于2023年2月表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间

结构

差速离心(在0.25M蔗糖溶液中)速率-区带梯度离心(5～50%蔗糖)

等密度离心(其他介质,如CsCl等)

细胞核800-1000g×10min500g×10min4000g×60min

线粒体10,000g×20min5000g×10min80000g×100min

溶酶体10,000g×20min5000g×10min80000g×100min质膜(大片)100,000g×15min～100,000g×100min～150,000g×600min内质网片段150,000g×40min1000g×20min100,000g×200min微粒体100,000g×60min10,000g×30min100,000g×360min小颗粒100,000g×60min第10页，课件共23页，创作于2023年2月各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数

图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数

根据1924年Svedberg（离心法创始人--瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S,即1S=10-13秒看图思考：要将细胞匀浆液中的得到更纯的分离，选用哪种离心方法较好？(线粒体:1.18g/ml、溶酶体:1.12g/ml、微体:1.23g/ml)第11页，课件共23页，创作于2023年2月离心力与离心机转速转换公式：图2:离心力与离心机转数的转换列线图RCF＝1.118×10-5×r×(n)２

(×g)式中,RCF表示相对离心力,单位是重力加速度g（980厘米/秒2）,(×g)表示重力加速度的倍数,r为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；n为转子每分钟的转数（rpm）。为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在此公式的基础上制作了离心力的列线图。见图2.先在离心机半径标尺上取已知的离心半径和在转速标尺上取已知的转速，然后在这两点间取一条直线，与中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的相对离心力数值，也是文献中常用的×g。

r=8cmn=15,000rpmRCF≈20,000×g第12页，课件共23页，创作于2023年2月荧光荧光显微镜观察荧光现象：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光,称为自发荧光。如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为间接荧光。如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。第13页，课件共23页，创作于2023年2月1.两组光源:透射照明光源(卤素灯)；荧光光源(超高压直流汞灯或氙灯)；2.有特殊的滤光片:激发滤色片和阻断滤片3.激发光波长：较短，因此，分辨力高于普通显微镜；4.荧光光源照明方式：通常为落射式。紫外光(UV)：激发光谱区域：330-400nm;

紫光(V)：激发光谱区域：395-415nm;

蓝光(B)：激发光谱区域：420-485nm;绿光(G)：激发光谱区域：460-550nm；荧光显微镜的特点：图：落射式荧光显微镜的光路第14页，课件共23页，创作于2023年2月荧光染料:吖啶橙(acridineorange)吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料在紫外光或蓝光(330～485nm)激发下，DNA可被激发出530nm的荧光发射峰(细胞核发亮绿色荧光)，RNA可被激发出640nm的荧光发射峰(核仁和胞质RNA发桔红色荧光)。产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA

和单链DNA或RNA的结合方式和结合量不同而决定的。DNA是高度聚合物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链DNA或RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的RNA.第15页，课件共23页，创作于2023年2月加入吖啶橙后叶绿体的自发荧光（火红色）消失了？原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种芳香杂环阳离子型染料，可透过细胞膜，因此而推测吖啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子的结构或所处的化学环境使自发荧光淬灭的。荧光淬灭：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使溶液的吸光度下降而荧光强度变小的现象。

荧光淬灭现象产生原因：分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素（pH、温度、光、淬灭剂）.第16页，课件共23页，创作于2023年2月

实验用品材料：菠菜叶片试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO)

仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸水纸等配制方法：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，放冰箱备用，临用前取1ml干液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml。第17页，课件共23页，创作于2023年2月菠菜叶片(去叶脉)3g

→0.35mol/L氯化钠15ml→研磨(冰浴)→匀浆过滤(2层尼龙网)→滤液在1000rpm离心2min→弃沉淀，上清液3000rpm离心5min

→去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮

→滴片观察取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片,使用荧光显微镜观察间接荧光取叶表皮临时装片荧光染色观察

实验步骤第18页，课件共23页，创作于2023年2月实验结果普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈黄绿色。图：叶绿体自发荧光为火红色第19页，课件共23页，创作于2023年2月第20页，课件共23页，创作于2023年2月叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。离心机使用：离心管要平衡荧光显微镜使用荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛凡是荧光染料都有