基因重组与基因工程

关于基因重组与基因工程第1页，课件共49页，创作于2023年2月第二节工具酶第三节自然界的基因转移和重组第一节概述第四节基因载体第五节目的基因第六节重组DNA技术的基本过程第七节基因工程在医学上的应用第十五章基因重组与基因工程第2页，课件共49页，创作于2023年2月分子克隆：在体外对DNA分子按照既定的目地和方案进行人工重组，将重组DNA分子导入合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增繁殖，以获得目地DNA分子的大量拷贝，并使受体细胞获得新的遗传性状的过程。基因工程：利用分子克隆技术操作目地基因，并改变生物遗传性状的过程，即采用类似工程技术的方法，在体外进行基因重组，使重组基因在适当的宿主细胞中得到表达。第一节概述结束放映返回目录第3页，课件共49页，创作于2023年2月第二节工具酶指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等基因操作有关的各种酶系，统称为工具酶。结束放映返回目录第4页，课件共49页，创作于2023年2月结束放映返回目录常用的工具酶(接下表)DNA连接酶连接双链DNA分子中的单链切口形成磷酸二酯键 工具酶名称 主要功能DNA聚合酶I5`→3`DNA聚合酶活性限制性核酸识别双链DNA的特异序列，切割DNA5`→3`外切酶活性3`→5`外切酶活性内切酶第5页，课件共49页，创作于2023年2月常用的工具酶工具酶名称 主要功能在3`-OH末端进行同一多聚物加尾反转录酶DNA末端转移酶碱性磷酸酶去除DNA、RNA、dNTP的5`磷酸基团结束放映返回目录以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链，水解杂化双链中的RNATaqDNA聚合酶能在高温（72℃）下，以单链DNA为模板，从5`→3`方向合成新生的互补DNA链 第6页，课件共49页，创作于2023年2月<一>限制性核酸内切酶按限制性核酸内切酶的分解模式，分为三类类型I

有识别位点,切割长短不一且无特异性类型II具有识别和切割的特异性，切割后产生粘性末端或平头末端类型III

界于I和II之间1、限制性核酸内切酶的分类结束放映返回目录第7页，课件共49页，创作于2023年2月①均能严格地识别特定核苷酸的序列（4－8个碱基对）。②大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式（回文结构）。③能在识别的核苷酸序列当中或附近切割双链DNA。2、II型酶识别序列特点：结束放映返回目录第8页，课件共49页，创作于2023年2月3、II型限制性内切酶的切割方式三种切割方式

一种是在对称轴5`侧切割产生5`粘端，EcoRI5`----NGAATTCN----3`

5`----NGAATTGN----3`结束放映返回目录3`----NCTTAAGN----5`3`----NCTTAACN----5`5`粘性末端GAATTCCTTAAG第9页，课件共49页，创作于2023年2月结束放映返回目录另一种是在对称轴的3`侧切割产生3`粘端，PstI5`----NCTGCAGN----3`3`----NGACGTCN----5`CTGCAGGACGTC5`----NCTGCA3`----NGCTGCAGGN----3`ACGTCN----5`GACGTC3`-粘性末端第10页，课件共49页，创作于2023年2月第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末端SmaI5`----NCCCGGGN----3`3`----NGGGCCCN----5`CCCGGGGGGCCC5`----NCCC3`----NGGGCCCGGGGGGN----3`CCCN----5`GGGCCC平头末端结束放映返回目录第11页，课件共49页，创作于2023年2月4、某些限制性内切酶的识别切割序列结束放映返回目录HindⅢNotⅠPstⅠPvuⅡTthⅢBamHⅠClaⅠEcoRⅠEcoRⅤHaeⅢ5`---GGATCC---3`

5`---ATCGAT---3`

5`---GAATTC---3`

5`---GATATC---3`

5`---GGCC---3`

5`---AAGCTT---3`

5`---GCGGCCGC---3`

5`---CTGCAG---3`

5`---CAGCTG---3`

5`---GACNNNGTC---3`

第12页，课件共49页，创作于2023年2月<二>DNA连接酶连接双链DNA分子中的单链切口,形成磷酸二酯键主要应用：DNA片段粘性末端连接。DNA片段平头末端连接（效率低100-200倍）

结束放映返回目录OH5`5`3`3`P连接酶5`5`3`3`第13页，课件共49页，创作于2023年2月<三>末端脱氧核苷酸转移酶能催化dNTP依次聚合到DNA的3`末端。以3`端突出的DNA末端最好。主要应用：给目的DNA、cDNA和载体加上互补的多聚脱氧核苷酸尾巴(人工粘性末端)。结束放映返回目录第14页，课件共49页，创作于2023年2月结束放映返回目录5’3’3’5’5’5’3’3’载体DNA+dGTP目的DNA+dCTP末端脱氧核苷酸转移酶3’3’3’3’PolyGPolyGPolyCPolyCPolyGPolyC同聚物加尾连接法第15页，课件共49页，创作于2023年2月<四>逆转录酶以

mRNA为模板，利用逆转录酶催化合成与mRNA互补的DNA。合成的产物称cDNA(complementaryDNA)主要应用：逆转录合成cDNA及DNA探针，补平和标记粘性末端。结束放映返回目录第16页，课件共49页，创作于2023年2月mRNA3`…AAAAAA…5`TTTTTT…5`逆转录酶4种dNTPRNA-DNA…AAAAAA…5`3`3`TTTTTT…5`结束放映返回目录RNA-DNA杂交体的生成第17页，课件共49页，创作于2023年2月<五>DNA聚合酶I•主要应用：DNA序列分析、催化DNA切口平移制备探针、DNA3`端标记、cDNA第二链的合成。结束放映返回目录第18页，课件共49页，创作于2023年2月第三节自然界的基因转移和重组---细菌中遗传物质的几种转移形式:接合转化转导转座结束放映返回目录第19页，课件共49页，创作于2023年2月接合染色体DNAF因子转移细菌接合：指通过细菌鞭毛的直接接触，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。1、接合作用结束放映返回目录供体细胞受体细胞第20页，课件共49页，创作于2023年2月2、转化作用转化：自动的获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。细胞溶解新细菌摄取DNA重组图15-2转化作用结束放映返回目录供体细胞受体细胞第21页，课件共49页，创作于2023年2月3、转导作用转导：通过病毒或噬菌体介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。溶菌感染重组感染细菌噬菌体结束放映返回目录供体细胞受体细胞第22页，课件共49页，创作于2023年2月4、转座转座：由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。

结束放映返回目录第23页，课件共49页，创作于2023年2月第四节基因载体一、载体的概念携带和运载目的DNA进入宿主细胞的一些DNA分子,它可以使目的DNA随着宿主细胞的增殖而无性繁殖或/和在宿主细胞中表达目的DNA。可分为克隆载体和表达载体。

结束放映返回目录第24页，课件共49页，创作于2023年2月作为载体的DNA分子有质粒DNA，噬菌体DNA和病毒DNA等。它们经人为改造后在宿主细胞中只具有自我复制能力的DNA为克隆载体；能使插入的目的DNA无性繁殖，并使其在宿主细胞中表达而特意设计的DNA为表达载体。结束放映返回目录二、载体的种类第25页，课件共49页，创作于2023年2月

质粒：是存在于细菌染色体外小型双链环状DNA，能在宿主细胞中独立地复制，并在细胞分裂时传递给子代细胞，其DNA分子上的基因对宿主细胞的代谢活动和抗药性的表型均有一定的作用。可赋予细菌特定的表型，如抗生素抗性，是筛选转化子细菌的遗传标志。结束放映返回目录第26页，课件共49页，创作于2023年2月pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmalXmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447Amlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac质粒pUC19结束放映返回目录第27页，课件共49页，创作于2023年2月三、载体的特点1、载体必须是复制子，在宿主细胞中能大量复制。2、同一限制性核酸内切酶在载体上只有单一酶切位点。3、具有选择性遗传标志。第28页，课件共49页，创作于2023年2月

一、概念为基础研究和应用研究的需要而分离获得的某一感兴趣的基因（DNA序列），或者是为得到某一感兴趣的蛋白质或RNA所对应的DNA序列。有两种类型，既cDNA和基因组DNA。二、目的基因的获取（见后）第五节目的基因结束放映返回目录第29页，课件共49页，创作于2023年2月第六节重组DNA技术的基本过程制备目的基因和相关载体。将目的基因和载体进行体外连接。将重组的载体DNA导入宿主细胞。DNA重组体的筛选和鉴定。DNA重组体的扩增表达。结束放映返回目录第30页，课件共49页，创作于2023年2月载体+重组子转化或转染目的DNA细菌重组DNA增殖筛选含重组质粒的细菌（以质粒为载体的DNA克隆过程）结束放映返回目录阳性克隆的筛选及扩增第31页，课件共49页，创作于2023年2月一、目的基因的获取1、从基因组DNA中分离获得2、从基因文库中筛选获得（基因组文库及cDNA文库）3、化学合成法4、PCR扩增5、mRNA逆转录结束放映返回目录第32页，课件共49页，创作于2023年2月1、从基因组DNA文库中筛选获得（1）基因组DNA文库：分离组织或细胞染色体DNA，用限制性核酸内切酶将其切割成许多片段后将它们与克隆载体拼接成重组DNA，将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称基因组DNA文库。结束放映返回目录第33页，课件共49页，创作于2023年2月（2）文库的筛选：直接选择法：抗药性选择、分子探针、标志补救（如α-互补筛选）。

免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行的筛选（如酶免检测分析）。结束放映返回目录第34页，课件共49页，创作于2023年2月多克隆位点

启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA半乳糖苷酶N端编码序列染色体重组体pUC18细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养pUC18含重组体pUC18的白色菌落蓝色菌落含载体pUC18的蓝色菌落半乳糖苷酶C端编码序列转化转化amprAmpr(利用互补原理筛选重组子Puc18)pUC182686bppUC182686bp结束放映返回目录第35页，课件共49页，创作于2023年2月蓝白斑筛选重组质粒与PCR鉴定重组质粒结束放映返回目录第36页，课件共49页，创作于2023年2月硝酸纤维膜菌落琼脂培养板硝酸纤维膜复制培养溶菌、中和蛋白酶处理漂洗、烘干1、32P探针杂交

2、放射自显影

鉴定克隆（含感兴趣DNA）

原位杂交结束放映返回目录第37页，课件共49页，创作于2023年2月2、从cDNA文库中筛选获得（1）cDNA文库：将总mRNA逆转录生成cDNA，再复制成双链cDNA的混合体并与适当的载体进行拼接成重组DNA，使每一个cDNA分子只与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为cDNA文库（2）cDNA文库的筛选：（见上）结束放映返回目录第38页，课件共49页，创作于2023年2月3、化学合成法

用DNA合成仪合成所需要的目的基因片断。结束放映返回目录

PCR是一种在体外利用DNA聚合酶催化反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的技术。（详见后第22章PCR）4、PCR法：第39页，课件共49页，创作于2023年2月二、目的基因与载体的连接粘性末端连接利用人工接头连接加入同聚体尾连接结束放映返回目录第40页，课件共49页，创作于2023年2月细菌质粒CCGGGGCCHpaIICGGCCGGCCCGGCCGGGGCCGGCC哺乳动物DNA片断HpaIICGGCCGGC+混合、DNA连接酶催化细菌质粒与哺乳动物DNA片断共同构重的重组质粒(同一限制酶切割DNA粘性末端的连接)CCGGGGCCCCGGGGCC结束放映返回目录第41页，课件共49页，创作于2023年2月三、重组DNA导入