DB63T 1163-2012牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程

ICS20.30-2013青海省地DB63方标准DB63/T1163—2012牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程青海省质量技术监督局发布IDBT012前言。1DBT012生产技术操作规程引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB牛冷冻精液GBT25881牛胚胎NYT1674牛羊胚胎质量检测技术规程义tromaturationIVMInvitrofertilization，IVFInvitroembryoproduction，IVEP通过采集牦牛卵母细胞，将之经过体外成熟培养(Invitromaturation，IVM)后与获能的精子进试剂、耗材、设备和实验室要求4.1试剂2DBT0124.2耗材4.3设备4.4实验室要求作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积不小于3平方米，并设有柜和紫外灯。紫外灯管距地面不应超过2.5米，每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，每次照射时间附录B。卵母细胞采集5.1活体采卵屠宰后的牦牛卵母细胞的采集牦牛屠宰后30分钟内从体内摘取卵巢，置于25℃~35℃含青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100牦牛卵母细胞筛选将收集到的卵泡液转入直径100毫米培养皿中，在实体显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocytecomplexes,COCs)，并按如下方法进行分类，A、B级用于体外受精:细胞体外成熟母细胞成熟培养CO2培养箱平衡2小时。将收集的A级和B级COCs在成熟培养液清洗3遍后，每15个COCs转入50微升成熟培母细胞成熟的判定3DBT012透明质酸酶除去卵丘细胞后能见到第一极体(Pb1)为已成熟，否则为未成熟卵母细胞。胞体外受精精微滴制作液的清洗分离冷冻精液品质鉴定依据GB4143。细管冷冻精液在37℃温水解冻40秒后，转入Percoll梯度分离液(45%/90%)中1500转/分钟离心20分钟，弃掉上清液后加入BO工作液(BOworkingsolution)1000转/受精受精卵培养。胚胎的鉴定和分级1牦牛胚胎的鉴定度与受精卵。a)桑葚胚(morula)——可观察到球状的细胞团，细胞团占透明带内腔50%~60%。b)致密桑葚胚(compactedmorula，CM)——卵裂球细胞进一步分裂变小，细胞团占透明带内腔d)囊胚(blastocyst，BL)——内细胞团和滋养层界限清晰，囊胚腔明显，细胞充满透明带内腔。f)孵化囊胚(hatchedblastocyst，HB)——囊胚腔继续扩大，透明带破裂，细胞团脱出。4DBT0122牦牛胚胎分级NYT4：C5DBT012(规范性附录)A1主要试剂及要求A.1.1主要试剂lNaHPOKHPOCaCl酚红(PhenolRed)、葡萄糖、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、胎牛血清(FBS)、犊牛血清(CS)、牛血清白蛋白(BSA)、Theophylline、石蜡油。A.1.2试剂要求Sigma。A.2主要耗材A2.1培养皿：35毫米、60毫米、100毫米A注射器：1毫升、10毫升、20毫升、50毫升A.3滤器：0.22微米、0.45微米A4离心管：0.5毫升、1.5毫升、10毫升、50毫升A50.25毫升塑料胚胎麦管A.2.6封口膜A.2.7胚胎吸管A.3主要设备A.3.1OA.2A.3.3A.4A.5A.3.6A.3.7作台A.8电子天平(精确到0.1毫克)A.9A.3.10A.3.11A.3.12A.3.137.5/5.0兆赫兹阴道扇形探头6DBT012(规范性附录)B涤B器皿清洗B1.1浸泡B2刷洗B3酸浸为酸液的配方见表B.1。B液的配方成重铬酸钾(克)浓硫酸(毫升)去离子水(毫升)B4冲洗酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用超纯水浸洗3次~5次，烘干包装。B器皿清洗的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同B.1.1。B与橡胶制品清洗胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡12小时，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30分钟，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干后备B毒7DBT012B湿热消毒灭菌MPaMPa规液体为0.15MPa15分钟。B过消毒B外线消毒B.2.3.1对空气、操作台表面和一些不能使用其他方法进行消毒的培养器皿(如塑料培养皿、培养板等)采用紫外线消毒。B每塑料吸管需垂直置于紫外灯下照射30分钟以上。B热消毒灭菌的玻璃及金属器具，包装好后放入烘干消毒箱内160℃处理1小时~1.5小时，或者在温度升。8DBT012(规范性附录)C液的配制C.1.1改进PBS液的配方(m-PBS)PBSCCmPBS配方ClNaHPO4POCm-PBS液的配制B液配制：将CaCl2和MgCl2.6H2O用超纯水配制成约100毫升溶液；霉素和链霉素再加入到混合液中溶解，并用超纯水定容至1000毫升。调节PH为7.2~7.4，渗透压为255C卵液的配制采卵液为含3%CS的m-PBS液，即将配好的m-PBS液取97毫升，再加入3毫升犊牛血清(CS)，0.22微米C成熟培养液C各种保存液的配制4℃保存一周。FSH保存液：以20单位/毫升浓度将FSH溶于生理盐水中，然后每10微升分装到0.5毫升离心管中，9DBT012EETCMTCM99含25毫摩尔Hepes和0.26毫摩尔NaHCO3C成熟培养液C方TCM-