发酵工业培养基及原料处理

关于发酵工业培养基及原料处理第1页，课件共64页，创作于2023年2月发酵工业培养基是工业发酵微生物生长和分泌发酵产物的营养基质。发酵工业培养基的设计、原料处理和配制是发酵工程的重要操作单元之一。第2页，课件共64页，创作于2023年2月本章主要内容第一节发酵营养基质的组成第二节工业发酵中营养基质的种类第三节培养基的设计和优化第四节原料的选择及工业发酵中

重要营养基质的配制方法第3页，课件共64页，创作于2023年2月第一节发酵营养基质的组成

培养基定义：是指利用人工方法配制的供微生物、植物和动物细胞生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质的混合物。

用途：

主要用于微生物等的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。

工业发酵培养基??除了包含微生物生长繁殖所必须的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分，有的还含有某些前体、产物促进剂和抑制剂等。第4页，课件共64页，创作于2023年2月一、能源

功能：微生物生长、繁殖、合成、分解、运动、热的产生等，即微生物的一切行为都需要消耗能源。光能------光能自养菌的能源。如：小球藻、螺旋藻利用光能生产单细胞蛋白；嗜盐藻利用光能生产甘油、β-胡罗卜素和单细胞蛋白等。氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐------化能自养微生物的能源。如：细菌炼铜所使用的氧化亚铁硫杆菌，将亚铁盐作为能源。碳水化合物等有机物，石油天然气和石油化工产品------异养微生物能源，同时也是碳源物质。NewBiofueltechnologyusingsunlightandmicro-organismscouldchangetheindustry第5页，课件共64页，创作于2023年2月二、碳源

功能：碳源物质是组成培养基的主要成分之一，因为碳源物质在微生物细胞中的含量很高。占细胞干物质50%。

碳源物质为细胞提供能量、组成菌体细胞成分的碳架、构成代谢产物。

常用的碳源物质:糖类、脂类、有机酸、低碳醇。

糖蜜淀粉第6页，课件共64页，创作于2023年2月7葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、淀粉等糖类物质，是细菌、放线菌、霉菌、酵母利用的碳源。其中，葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖，几乎所有微生物都能利用葡萄糖。其他糖类：蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖也是常用的碳源。常用于抗生素、氨基酸、酶类的发酵。多糖

如淀粉和纤维素。淀粉还可以克服葡萄糖代谢过快的弊病，并且价格低廉，来源丰富。第7页，课件共64页，创作于2023年2月8酯类：如植物油，动物油等脂类，具备较活跃的脂肪酶的微生物可利用脂类为碳源。有机酸：有机酸或他们的盐类或醇类能做为碳源。pH会有变化。烃类：碳酸气、石油、正构石蜡、天然气、甲醇、乙醇等石油化工产品，也是许多微生物碳源。如：嗜甲烷棒状杆菌利用甲醇为碳源产生单细胞蛋白；乳糖发酵短杆菌，以乙醇为碳源生产谷氨酸。第8页，课件共64页，创作于2023年2月例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2第9页，课件共64页，创作于2023年2月三、氮源

功能：氮源物质构成菌体细胞结构物质（氨基酸、蛋白质、核酸）；为微生物提供能源；合成含氮的代谢产物。常用的氮源分为两类：无机氮源和有机氮源。1.无机氮源主要包括氨水、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐等。其被利用速度及吸收速度均快于有机氮源，也被称为速效氮源。一般情况下作为辅佐氮源。生理酸性氮源和生理碱性氮源常被用来做发酵过程中培养基pH调节的一种有效手段。第10页，课件共64页，创作于2023年2月11主要成分复杂的工农业下脚料，包括豆粉、玉米粉、豆饼、鱼粉、蚕蛹粉、酿酒工业的酒糟等。

玉米浆：一般含10%左右的乳酸，pH值在4左右，一般用于抗生素发酵。尿素（脲）：抗生素和氨基酸发酵，尤其是谷氨酸的生产。能分泌脲酶的微生物才能利用。氮含量高达50%，但是营养成分单一。蛋白胨（动物组织和植物水解制备）：实验室用有机氮源。鱼粉酒糟2.有机氮源污水污泥

第11页，课件共64页，创作于2023年2月四、无机盐及微量元素

功能：构成菌体的成分；酶的组成部分或其激活剂、抑制剂；调节渗透压、菌体内部pH以及氧化还原电位等等。大量元素（0.1～1mM），包括P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe，常常以盐的形式加入培养基。如：磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等。微量元素（0.01～1mM），包括Cu、Zn、Mn、Mo和Co等，Co是发酵微生物B12的激活剂。第12页，课件共64页，创作于2023年2月例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理.此外、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330生产α-淀粉酶，P对酶活的影响

pH酶活不加4.25120U加K2HPO45.4530U加KH2PO44.6275U第13页，课件共64页，创作于2023年2月五、生长因子

功能：生长因子为微生物必不可少的物质，一般为小分子有机物，需求量很小。包括：维生素、碱基等。维生素中需求量最大的为B族维生素，多为生化代谢中的辅酶。一般不需要单独添加。天然原料（玉米浆、糖蜜、豆饼水）及实验室培养基（酵母膏）等都已经含有。应用实例：生物素——合成生物质膜的重要辅酶，不足会造成细胞膜不完整，细胞内容物的渗漏。添加亚适量（5mg/L），可即使菌体生长少受抑制也可以使过多的谷氨酸因外泄而源源不断地合成。第14页，课件共64页，创作于2023年2月六、前体物质前体物质指添加到培养基中的物质，并不促进微生物生长，而是直接经微生物的生物合成过程结合到产物分子上去，其自身结构基本不变，而产物产量却因此提高。可看作是一种底物。过量则对菌体有毒！方式：流加。第15页，课件共64页，创作于2023年2月16例子：最早在青霉素发酵中发现前体物质。发现添加玉米浆可提高青霉素G的含量，深入研究发现玉米浆含有苯乙酸，苯乙酸是青霉素G的侧链，即苯乙酸是青霉素G发酵的前体物质。不同青霉素的侧链不同：青霉素V------苯氧乙酸链霉素------肌醇、甲硫氨酸、精氨酸红霉素------丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐……第16页，课件共64页，创作于2023年2月七、促进剂和抑制剂1、促进剂：并不是前体或营养物质，但却能提高产量的物质。作用方式：或影响微生物正常代谢；或促进中间产物的累积；或提高次级代谢产物量。如：巴比妥盐能增加生产菌菌丝的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶目的，增加链霉素和利福霉素等抗生素的累积。如：谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸的时候，加入红霉素可以提高产量25%以上，加入表面活性剂可以增加产量30%以上。第17页，课件共64页，创作于2023年2月182、抑制剂：

一些对生产菌代谢途径有某种调节能力的物质。抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一个代谢途径，之一改变代谢途径，如：酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以促进酒精发酵转入甘油发酵。淘汰杂菌的抑制剂，如：真菌发酵中加入抗生素；带抗生素抗性的工程菌发酵中加入该抗生素，淘汰非重组细胞或突变细胞。第18页，课件共64页，创作于2023年2月八、水（1）水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。（2）渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；（3）水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。（4）水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。（5）水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。第19页，课件共64页，创作于2023年2月第二节工业发酵中营养基质的种类

一、天然、合成、半合成培养基1、天然培养基（undefinedmedium）：是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨、玉米浆、各种淀粉水解液、糖蜜等)制成的。优点：取材方便、营养丰富、价格低廉、适用范围广；缺点：原料质量不稳定，不利于发酵控制。第20页，课件共64页，创作于2023年2月212、合成培养基（definedmedium）：

是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的，成分精确，重复性强，可以减少不能控制的因素。适用:在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。缺点：营养单一，价格高，适用范围较窄。第21页，课件共64页，创作于2023年2月223、半合成培养基（semi-definedmedium）：

既有天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，又含有一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。

大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。在微生工业生产上和试验研究中被广泛使用。第22页，课件共64页，创作于2023年2月二、液体、固体、半固体培养基液体培养基（liquidmedium）：常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。在菌种筛选工作和菌种扩大培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养。第23页，课件共64页，创作于2023年2月二、固体、液体、半固体培养基固体培养基（solidmedium）：是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。分类：斜面试管、平板等。半固体培养基（semi-solidmedium）：0.5%琼脂。主要用于实验室的微生物运动观察（穿刺培养），某些厌氧菌的保藏工作。第24页，课件共64页，创作于2023年2月三、鉴别和选择性培养基鉴别培养基（differentialmedium）：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。选择培养基（selectivemedium）：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某种物理化学因素的抗性而设计的培养基，目的是使混合样品中的劣势菌群变成优势菌群，或同时还会加入一些特殊的抑制剂来抑制竞争菌群。蓝白筛选平板多种肠道菌群用EMB培养基来鉴别第25页，课件共64页，创作于2023年2月1）孢子培养基：

供菌种繁殖孢子，常采用固体培养基，目的是在使发酵菌种不发生变异的前体下尽可能多的产生孢子。基本要求:

在营养基本保证、理化条件适宜的前提下，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。四、发酵生产的培养基生产商常用的：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基等。第26页，课件共64页，创作于2023年2月四、发酵生产的培养基2）种子培养基：

供孢子发芽生长出大量的菌丝体，或不产生孢子放入菌种繁殖出大量的细胞，并具有较高的活力和纯度的培养基。特点：

1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子；

2.供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源；

3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近，使种子尽快适应发酵培养基，缩短周期。第27页，课件共64页，创作于2023年2月3）发酵培养基：

供菌种生长繁殖和合成发酵产物的培养基。是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。

（1）根据产物合成的特点来设计培养基。对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。

第28页，课件共64页，创作于2023年2月29xp〖一类发酵〗

产物的形成和菌体的生长相偶联第29页，课件共64页，创作于2023年2月（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。第30页，课件共64页，创作于2023年2月第三节培养基的设计和优化一、培养基的选择（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求（见表四大类微生物的典型培养基）。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。第31页，课件共64页，创作于2023年2月第32页，课件共64页，创作于2023年2月第三节培养基的设计和优化(2)对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验；第33页，课件共64页，创作于2023年2月二、工业发酵营养基质的选择1、营养基质的种类。2、营养基质原材料的质量问题。3、营养基质选择的经济原则。第34页，课件共64页，创作于2023年2月③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。如：正交实验设计、响应面实验设计等。三、培养基设计的步骤①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；第35页，课件共64页，创作于2023年2月例：类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健.第36页，课件共64页，创作于2023年2月原培养基:第37页，课件共64页，创作于2023年2月

初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)第38页，课件共64页，创作于2023年2月

通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好第39页，课件共64页，创作于2023年2月结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%

酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%第40页，课件共64页，创作于2023年2月

正交设计确定优化的配方第41页，课件共64页，创作于2023年2月直观分析法组合A1B2C3D1最优第42页，课件共64页，创作于2023年2月改进后培养基原培养基改进后培养基的发酵结果第43页，课件共64页，创作于2023年2月四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次

摇瓶——培养基设计的第一步

反应器—最终的优化的基础配方第44页，课件共64页，创作于2023年2月例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)2SO40.8%

轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大第45页，课件共64页，创作于2023年2月摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础第46页，课件共64页，创作于2023年2月发酵罐：反应器水平,

可以得出最终优化的基础配方第47页，课件共64页，创作于2023年2月第四节原料的选择及工业发酵中

重要营养基质的配制方法一、原料的定义及选择原则1、原料的定义：

从工艺角度来讲，凡是能被微生物利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可作为发酵工业生产的原料。2、原料选择的原则资源丰富，价格低廉，易收集，易储藏，对人体无害，影响发酵过程的杂质含量应极少或几乎不含。第48页，课件共64页，创作于2023年2月二、常用主要原料常用原料种类—薯类：甘薯、马铃薯、木薯、山药等。粮谷类：高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦等。野生植物：橡籽仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香附子等。农产品加工副产物：米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。非粮食生物质原料：纤维素、木质素、半纤维素等。第49页，课件共64页，创作于2023年2月三、发酵工业中重要营养基质的配制方法1、淀粉的组成和特性（1）淀粉颗粒的外观

淀粉颗粒呈白色，不溶于冷水和有机溶剂，其内部呈复杂的结晶组织。形状不规则，大致上可分为圆形、椭圆形和多角形。

偏光显微镜下淀粉颗粒的偏光十字(×400倍)显微镜下淀粉颗粒结构板栗淀粉粒（一）淀粉质原料制糖工艺及培养基的配制方法籼米淀粉粒偏光显微镜下淀粉颗粒的偏光十字(×400倍)显微镜下淀粉颗粒结构薏米淀粉粒第50页，课件共64页，创作于2023年2月（2）淀粉分子的组成淀粉的本质是由葡萄糖脱水聚合而成的，可以表示为（C6H10O5）n。可分为直连淀粉和支链淀粉，直链淀粉通过α-1，4键连接。支链淀粉的直链部分通过α-1，4键连接，分支点则有α-1，6键连接。

支链淀粉淀粉分子颗粒构成过程：淀粉分子链针状晶体淀粉颗粒氢键聚集淀粉分子颗粒构成过程：淀粉分子链针状晶体淀粉颗粒氢键聚集第51页，课件共64页，创作于2023年2月2、淀粉水解的原理（1）淀粉的水解反应

淀粉糖化中的主要反应，本质是α-1，4键和α-1，6键被打开，分子量逐渐减小，糖苷键的断裂是随机的。反应趋势是：淀粉→糊精→低聚糖→葡萄糖。

第52页，课件共64页，创作于2023年2月（2）葡萄糖的复合反应葡糖在热和酸的情况下发生聚合反应，生成异麦芽糖、龙胆二糖等等，反应可逆，可经过再加酸水解一次来减少。（3）葡萄糖的分解反应葡糖发生的较弱的脱水反应，生成5-羟甲基糠醛，又进一步分解为乙酰丙酸、甲酸等，这些物质相互聚合，或与氨基酸聚合，生成有色物质。淀粉淀粉水解反应糊精麦芽糖葡萄糖复合反应分解反应复合二糖5-羟甲基糠醛低聚糖有机酸、有色物质图淀粉水解过程中发生的化学反应第53页，课件共64页，创作于2023年2月3、淀粉水解糖制备方法（1）酸解法（acidhydrolysismethod）

淀粉水解糖制备的传统方法，它是以无机酸（现在也用有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。优点：工艺简单、水解时间短、设备生产能力大。目前广泛采用此法。缺点：高温高压以及酸的腐蚀对设备有一定要求；副反应多，影响水解液质量；对原料要求严格，原料淀粉颗粒必须大小均匀，否则造成水解不均一不彻底；废水难处理。第54页，课件共64页，创作于2023年2月（2）酶解法（enzymehydrolysismethod）是用专一性很强的淀粉酶将原料淀粉水解为糊精和低聚糖，再用糖化酶继续水解为葡糖的制糖工艺。酶解法一般分为两步进行：液化（liquification）和糖化（saccharification），因为都用到酶，所以又称双酶水解法（double-enzymehydrolysismethod）。优点：

条件温和，设备要求低；酶专一性强，副反应少；淀粉液初始浓度较高，要求较低（颗粒大小可以不均一）；糖液颜色浅，较纯净。缺点：

生产周期长（常需要数十个小时），需要专门设备（如培养酶的设备），过滤困难（酶是蛋白质）。第55页，课件共64页，创作于2023年2月（3）酸酶结合法（acid-enzymehydrolysismethod）

是结合了酸法和酶法的水解糖制备工艺，兼具两者特点。又可分为酸酶法和酶酸法两种。酸酶法：先将淀粉用酸水解成低聚糖和糊精，在用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。有些原料的淀粉，如玉米、小麦的淀粉颗粒坚实，适合此法。酶酸法：是先用α-淀粉酶将原料淀粉水解到一定程度，过滤除去杂志后，再用酸完全水解的工艺。该法适用于较粗的原料，如大米淀粉，可以弥补酸法对原料要求较高的缺点，提高原料利用率。第56页，课件共64页，创作于2023年2月表酸法和酶法制糖工艺比较比较项目酸法酶法葡萄糖值（DE值）9198淀粉原料浓度18%～21%34%～40%葡萄糖含量（干重）86%97%灰分1.6%0.1%蛋白质0.08%0.1%5-羟甲基糠醛0.3%0.003%色度10.00.2淀粉转化率90%98%工艺条件高温高压较温和过程能耗高低副产物多少生产周期短长设备规模小大设备生产能力大小设备要求耐高温高压，耐腐蚀不需耐高温高压，耐腐蚀葡萄糖收率较低较酸法高约10%第57页，课件共64页，创作于2023年2月4、淀粉水解法工艺流程（1）淀粉酸解法工艺流程：

淀粉→调浆→过筛→加酸→进料→糖化→放料→冷却→中和→脱色→过滤→糖液（2）淀粉酶水解法工艺流程：淀粉→液化→糖