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文档简介

学习情境4

微生物工程菌发酵制药技术目的基因的获得目的基因的获得对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于真核基因的内含子及基因的后翻译过程，所以真核系统得到了相应发展。目的基因—是指待在受体细胞中表达的外源基因，也称供体基因。对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的方法。目前克隆基因常用的方法有鸟枪法、逆转录法和化学合成法鸟枪法（Shotgunmethod）：使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方法。

使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段

再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达

如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的DNA片断就是所需要的DNA片断1.鸟枪法2.逆转录法（cDNA）

逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。cDNA克隆示意图1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定mRNA逆转录酶ss-DNADNA多聚酶IKlenow片段逆转录酶ds-cDNAds-cDNA3.人工合成法人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，50~60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。基因的人工合成就是指用有机化学合成和酶促合成的方法，使单核昔酸通过3',5’磷酸二醋键连接成寡核昔酸，多核昔酸和具有生物活性的完整的核酸分子。分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位

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