甾体激素类药物分析 全国优质课一等奖

P2-6甾体激素类药物的分析教学标准知识目标：药物的分类及基本结构以及可供分析的官能团；鉴别试验；特殊杂质检查和含量测定。技能目标：掌握本类药物的分类及基本结构以及可供分析的官能团；熟悉常用的鉴别试验及特殊杂质检查法；掌握比色分析法(四氮唑比色法、异烟肼比色法及柯柏反应比色法)；熟悉HPLC法及其在体内药物分析中的应用。什么是激素？激素（Hormone，荷尔蒙）----是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用。如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。基本结构和分类甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢菲母核，基本骨架为：一、肾上腺皮质激素常用的有氢化可的松、醋酸可的松、醋酸泼尼松等。结构特点：①A环3位为羰基、4，5位间为双键，形成共轭体系，标记为：Δ4-3-酮基（又称α、β不饱和酮结构），或写成:Δ4-C3=O；②C环11位上有羰基或羟基；③D环17位上有α-醇酮基侧链（），并且多数还具α-羟基。二、雄性激素及蛋白同化激素（1）临床常用的雄性激素为睾丸素（睾酮）的衍生物，如丙酸睾丸素、苯乙酸睾丸素。（2）常用的蛋白固化激素有苯丙酸诺龙（苯丙酸去甲睾酮）、康力龙、康复龙等。（1）结构特征（两种激素之共同点）：①A环3位Δ4-3-酮基（又称α、β不饱和酮结构）；②D环17位上无侧链，多为羟基。（2）两种激素结构之不同点：蛋白同化激素10位上大多无角甲基，有的4位有卤素。三、孕激素又称黄体素或孕酮，临床上主要为黄体酮、己酸孕酮、安宫黄体酮和甲地孕酮等。①A环Δ4-3-酮基（α、β不饱和酮结构）；②D环17位上有甲基酮，有些具有羟基；四、雌激素临床上常用雌二醇及其各种酯和炔雌醇及其衍生物，以及活性的雌酮、雌三醇等。①A环为苯环，3位上有酚羟基，10位无角甲基；②D环17位上有羟基或羰基，有的还有乙炔基。肾上腺皮质激素雄性激素与蛋白同化激素雌激素孕激素C3C3＝OΔ4-3=O或Δ1，4-3＝OC3＝OΔ4-3=OC3－OHA环为苯环C3＝OΔ4-3=OC10C13有两个角甲基有的两个有的一个（C13）C13有一个有两个角甲基C17α－醇酮基－OH或其酯－OH或有－C=CH甲酮基鉴别试验一、化学鉴别法（一）与强酸的呈色反应（甾核）许多甾体激素可与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色，主要与硫酸等呈色，机理可能是酮基的质子化反应。方法：取样品少许观察颜色、荧光

再观察鉴别试验一、化学鉴别法（一）与强酸的呈色反应（甾核）许多甾体激素可与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色，主要与硫酸等呈色，机理可能是酮基的质子化反应。方法：取样品少许，加硫酸，观察颜色、荧光，加水稀释后再观察。（二）官能团的反应1、C17－α－醇酮基的反应皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性，能与许多氧化剂，如氨制AgNO3、斐林试剂、四氮唑盐反应。其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色剂，还可用于含量测定。1、与碱性酒石酸铜试液反应

铜（Ⅱ）在碱性条件下可被还原物质还原为红色的氧化亚铜沉淀。如：中国药典鉴别氢化可的松2、与氨制硝酸银试液的反应

银（Ⅰ）在碱性条件下可被还原物质还原为黑色的金属银沉淀。如：中国药典鉴别醋酸去氧皮质酮3、与碱性四氮唑盐显色反应

氯化三苯四氮唑（或蓝四氮唑）在碱性条件下可被还原物质还原为红色的单甲鐕（或蓝色的双甲鐕）。2、酮基的呈色反应机理：分子中C3=O和C20=O能与一般羰基试剂如：2，4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等显色。主要是C3=O与异烟肼缩合生成异烟腙而呈黄色。盐酸酸性条件下：

Δ4-3＝O：即刻反应

Δ1，4-3＝O：1～3minC20＝O：长时间3、甲酮基或活性亚甲基的反应含H3C-C=O（甲酮基）和活性亚甲基的激素类药物与亚硝基铁氰化钠、芳香醛、间二硝基苯反应呈色。（1）甲酮基的呈色反应：如黄体酮与亚硝基铁、氰化钠呈蓝紫色，其它甾体呈淡橙色或不显色。（专属反应）（2）亚甲基的反应：如硫酸普拉睾酮与乙醇间二硝基苯、氢氧化钠呈紫红色4、酚羟基的呈色反应：A环为苯环的雌激素+重氮苯磺酸盐,生成红色偶氮染料。H+5、炔基的沉淀反应含炔基的甾体激素，如炔雌醇、炔诺酮，遇硝酸银试液，即生成白色的炔雌醇银盐沉淀及白色炔诺酮银沉淀。6、卤素的反应（有机氟的呈色反应）一些含有氟的甾体激素药物（如醋酸氟轻松、醋酸地塞米松等），以氧瓶燃烧后生成无机氟化物，再与茜素氟蓝及硝酸亚铈起呈色反应。7、酯的反应一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。本类药物C17或C21位上羟基的酯，可发生水解反应，生成相应的酸与醇，如为醋酸酯，水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。二、制备衍生物测定熔点利用甾醇、甾酮类药物与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲，或用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，然后测定它们的熔点进行鉴别。（一）缩氨基脲的生成如苯丙酸诺龙（甾酮）+缩氨脲苯丙酸诺龙缩氨脲（二）酯的水解如丙酸睾丸素睾丸素三、紫外分光光度法一些甾体激素药物分子中存在共轭系统，所以在紫外光区有特征吸收。四、红外吸收光谱一般是将供试品所绘制的IR光谱与药典附录中收载的标准IR图谱进行对照比较（多采用KBr压片法），完全一致者即为同一药物。五、薄层色谱主要用于甾体激素的鉴别、纯度检查及含量测定前分离和制剂稳定性研究，具有简便、快速、灵敏、分离度高等优点。六、高效液相色谱法在一定的色谱条件下，比较甾体激素样品与其对照品峰的保留时间进行鉴别。一般都规定在含量测定项下的高效液相色谱图中，供试品峰的保留时间进行应与对照品峰的保留时间一致。特殊杂质检查甾体激素类药物多由其它甾体化合物或结构类似的其它甾体激素经结构改造而来，所以可能带来原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂等杂质。有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。一、其它甾体的检查我国药典和一些国家近版药典，采用TLC法或HPLC法检查甾体激素类药物中的“其它甾体”。因为该法具有简便、快速、灵敏、分离效果好等优点，而广泛用于甾体激素药物的鉴别、检查结构相似的杂质等质量控制的方法。采用高低浓度对比法进行，即供试液与对照液均为同一物，但仅浓度有所不同。结果判断：中国药典正文中对供试品规定了杂质斑点数目和每个杂质斑点不得超过的限量。二、硒的检查本类中一些药物在后工序用二氧化硒脱氢，故应检查硒。三、残留溶剂检查（甲醇和丙酮的检查）此为地塞米松磷酸钠残留溶剂检查，中国药典采用GC法检查。四、游离磷酸盐的检查本法系利用在酸性溶液中磷酸盐中磷酸盐与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，再经过还原形成磷钼酸蓝（钼蓝）在740nm处有最大吸收。含量测定常用方法有容量法、比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱等。其中紫外分光光度法、四氮唑盐比色法、异烟肼法、铁-酚试剂比色法及HPLC法在药典中均有收载。一、高效液相色谱法各国药典采用反相高效液相法测定，方法一般为内标法。填充剂为十八烷基硅烷化键合硅胶；流动相多为甲醇-水、乙腈-水-异丙醇、甲醇-四氢呋喃-水等混合溶剂；检测器均为紫外光检测器，检测波长为240nm或254nm。为了提高分离效率、获得满意的峰形，有时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调节流动相的pH值。二、紫外分光光度法本类药物分子结构中有共轭体系△4-3-酮、△1，4-3-酮、苯环、酚羟基等结构。如皮质激素、雄性激素、孕激素及口服避孕药中有分子中α、β不饱和酮结构，在紫外光区240nm附近有最大吸收；具有苯酚结构的雌激素在280nm附近有最大吸收，均可用紫外分光光度法测定含量。三、比色法（一）异烟肼比色法1、方法原理甾体激素C3上酮基及某些其它位置上的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂如异烟肼、2，4-二硝基苯肼及氨基脲等起缩合反应，可作为含量测定的依据。异烟肼是目前广泛采用的一种，异烟肼（INH）试剂可与一些甾酮在酸性条件下形成黄色异烟腙，在一定波长处具有最大吸收。某些具有△4-3-酮和C20－酮基的甾体激素可形成双腙，如黄体酮、可的松、氢化可的松等。2、测定方法分别制备供试品、对照品溶液，再分别与异烟肼溶液反应，在420nm波长处分别测定吸收度并计算结果。（二）四氮唑比色法1、反应原理皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲鐕。生成的颜色随所用试剂和条件的不同而定，多为蓝色或红色。（三）Kober反应比色法1、方法原理雌激素的含量测定，曾经广泛应用Kober反应。该法是雌激素在硫酸的作用下，通过质子化、分子重排、脱氢等作用形成共轭多烯而显色。反应分为以下两步:①被硫酸氧化而形成黄色产物；②加水或稀硫酸稀释后继续氧化最终形成红色产物。2、测定方法：炔雌醇片四、生物样品中甾体激素的分析本类药物的药代学研究、生物利用度研究及违禁药物监测等均需测定生物样品中的甾体激素药物。生物样品中本类药物的分析要求方法的专属性强、灵敏度高，因本类药物的给药剂量小，血药浓度很低（ng级或更低）。体内有内源性的甾体激素，故测定方法多采用GC、HPLC法测定，特别是采用GC-MS、HPLC-MS法。使用MS作为检测器，分析方法的专属性和灵敏度更高。采用GC-MS法对诺龙等19种蛋白同化激素的人体代谢进行了研究。几种测定方法的特点及其应用方法名称测定基团主要试剂甾体类别高效液相色谱法Δ4-3=O或芳香A环C18柱甲醇（乙腈）－水各类甾体激素紫外分光光度法Δ4-3=O或Δ1，4-3＝OA环为芳香环溶剂（无水乙醇、乙醇、甲醇）肾上腺皮质激素雄性激素雌性激素口服避孕药四氮唑比色法C17－