固相膜免疫技术

关于固相膜免疫技术第1页，课件共63页，创作于2023年2月一、固相免疫测定B与F分离

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb第一节概述第2页，课件共63页，创作于2023年2月二、固相膜的特点多孔性

毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作简便第3页，课件共63页，创作于2023年2月三、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜第4页，课件共63页，创作于2023年2月四、固相膜的技术要求孔径：0.2~0.6μm或5~10μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示均一性第5页，课件共63页，创作于2023年2月固相NC膜第6页，课件共63页，创作于2023年2月第7页，课件共63页，创作于2023年2月第8页，课件共63页，创作于2023年2月五、固相微孔膜测定种类1.斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)2.免疫层析试验（immunochromatographyassay,ICA）3.斑点ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)

4.酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)5.免疫印迹法(ImmunoblottingTest,IBT)

6.放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

第9页，课件共63页，创作于2023年2月六、膜固相免疫测定的特点优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物第10页，课件共63页，创作于2023年2月

第二节免疫金标记技术

(ImmunogoldLabellingTechique)临床免疫学和检验第11页，课件共63页，创作于2023年2月一、概述1.概念

以胶体金作为标记物的免疫检测技术2.类型

免疫金组织化学技术金免疫技术金免疫测定技术第12页，课件共63页，创作于2023年2月二、胶体金基本知识1.胶体金的制备(1)在一定浓度的金溶液内加入定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液，即胶体金（colloidalgold）,也称金溶胶（goldsol）。(2)HAuCl4是主要原料，常用的还原剂有柠檬酸钠等。良好的胶体金应清亮透明，在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入NaN3防腐。第13页，课件共63页，创作于2023年2月2.四种粒径胶体金的制备及特性胶体金粒径胶体金特性（nm）呈色λmax16橙色518nm

24.5橙红522nm

41红色525nm

71.5紫色535nm

通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒第14页，课件共63页，创作于2023年2月方法金颗粒直径白磷法5~12nm抗坏血酸法8~13nm枸橼酸钠法16~95nm柠檬酸钠法16~147nm乙醇-超声波法6~10nm硼酸钠法2~5nm鞣酸-枸橼酸钠法15nm还原剂不同，胶体金颗粒大小及特性不同第15页，课件共63页，创作于2023年2月胶体金（ColloidalGold）15~60nm优质劣质第16页，课件共63页，创作于2023年2月三、免疫金的特性和制备

胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组化技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时，胶体金多与免疫活性物质（Ag或Ab）结合，这类结合物常称为免疫金。第17页，课件共63页，创作于2023年2月胶体金结合物（Conjugate）第18页，课件共63页，创作于2023年2月四、免疫金（银）染色（ImmunogoldsilverStaining，IGSS

）金标抗体待测抗原+金标抗体-抗原银染液银（金标抗体-抗原）第19页，课件共63页，创作于2023年2月银离子的还原剂：对苯二酚胶体金及银原子起催化作用第20页，课件共63页，创作于2023年2月免疫金（银）染色应用多用于组织化学检测敏感度低于其它标记免疫技术，但经银加强染色后敏感度与荧光免疫技术和酶免疫技术相当近年来发展了不少IGSS方法以替代荧光免疫技术，可以在普通显微镜下进行检测第21页，课件共63页，创作于2023年2月五、金免疫测定

斑点金免疫渗滤试验（DotImmunogoldFiltrationAssay,DIGFA）金免疫层析试验（gold

immuno－chromatographyassay，GICA）

第22页，课件共63页，创作于2023年2月1.斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）原理

硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的吸附性及可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成

第23页，课件共63页，创作于2023年2月DIGFA原理图操作示意图装置分解图盖微孔膜吸水垫料底第24页，课件共63页，创作于2023年2月第25页，课件共63页，创作于2023年2月技术类型双抗体夹心法

包被抗体待检抗原金标抗体间接法

包被抗原待检抗体金标抗抗体竞争法包被抗原待检抗原金标抗体斑点金免疫渗滤试验（DIGFA)第26页，课件共63页，创作于2023年2月技术要点试剂盒组成免疫金标记物渗滤装置（充满吸水垫料的塑料小盒,盒盖中央的小孔下面放置一片NC膜,膜上预包被Ag或Ab斑点）

洗涤液斑点金免疫渗滤试验（DIGFA)第27页，课件共63页，创作于2023年2月2.胶体金免疫层析试验原理

以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端横向渗移，犹如横向层析一般，层析过程中在适当部位进行抗原抗体反应第28页，课件共63页，创作于2023年2月第29页，课件共63页，创作于2023年2月胶体金免疫层析试验技术类型双抗体夹心法竞争法间接法

第30页，课件共63页，创作于2023年2月双抗体夹心法测抗原胶体金免疫层析试验第31页，课件共63页，创作于2023年2月ICA——间接法测抗体胶体金免疫层析试验第32页，课件共63页，创作于2023年2月第33页，课件共63页，创作于2023年2月IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3min3~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深第34页，课件共63页，创作于2023年2月第35页，课件共63页，创作于2023年2月GIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图第36页，课件共63页，创作于2023年2月ICA技术的发展1990年ABBOTT公司胶体硒标记ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原体彩色胶乳标记ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml

合成TnT质控点第37页，课件共63页，创作于2023年2月IFA肌红蛋白双孔法

S：测定孔

C：定量质控

100μg/LIFA微量白蛋白单孔法

T：测定孔

C1：定量质控30mg/LC2：定量质控200mg/L

结果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）参考值：30μg/L肝癌诊断值：>400μg/L结果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1测定线对照线

半定量测定第38页，课件共63页，创作于2023年2月

金免疫测定方法特点

试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条。

1.吸水材料2.免疫金复合物干片（下），硝酸纤维素膜（上）T：硝酸纤维素膜条包被特异抗体，R：参照区，包被有抗小鼠IgG。第39页，课件共63页，创作于2023年2月

金免疫测定方法评价

简便、快速、单份测定，立等结果，除试剂外无需任何仪器，且试剂稳定，适合于急诊检验，但不能定量。(pointofcaretest,POCT)”

第40页，课件共63页，创作于2023年2月

金免疫测定应用1.临床应用：定性分析，主要检测正常体液中不存在的生物活性物质，以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。（1）传染病：

病毒相应抗原、抗体；性病病原体；细菌；寄生虫。（2）激素：

生殖标志物，如诊断早早孕HCG、检测排卵的促黄体生成素、促卵泡激素（FSH）等。第41页，课件共63页，创作于2023年2月

金免疫测定应用

（3）心血管病：

急性心肌梗死的标志物：肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌红蛋白，肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质（PABP）等；与心血管疾病有重要关系的D-二聚体（D-dimer）（4）肿瘤：肿瘤标志物如前列腺特异抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜血免疫检测（FOB）等（5）自身免疫病：

抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自身免疫病的甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体

第42页，课件共63页，创作于2023年2月金免疫测定应用（6）毒品

检测：尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报道有可同时测7种毒品的GICA。（7）其它

检测：C-反应蛋白，半定量检测血清α-脂蛋白。2.非临床应用：

可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生物战剂的快速检测，兽医学及法医学等方面检测。

第43页，课件共63页，创作于2023年2月金免疫测定的重点和展望

临床应用的重点应放在（1）急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标志物。（2）有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病（病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病）流行病调查；（3）某些肿瘤（如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌）的普查及预防检查；（4）围产期的健康普查等。（5）作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。

第44页，课件共63页，创作于2023年2月金免疫测定今后的发展

(1)

全面提高质量。突出质量控制的保证。(2)

提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析，应尽量缩小差距。除使用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体（特别是配伍好的优质单抗），优质高比度的标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物素-链亲和素系统，应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。

第45页，课件共63页，创作于2023年2月金免疫测定今后的发展(3)

实现半定量和定量化。(4)

检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗体。

(5)

建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，以减少分离血清的时间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者床旁检查和边远地区的普查都有实际应用意义。第46页，课件共63页，创作于2023年2月第三节其他膜免疫测定技术第47页，课件共63页，创作于2023年2月一、斑点酶免疫吸附试验

——Dot-ELISA第48页，课件共63页，创作于2023年2月二、酶联免疫斑点试验

——ELISPOT20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。第49页，课件共63页，创作于2023年2月ELISPOT检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。第50页，课件共63页，创作于2023年2月第51页，课件共63页，创作于2023年2月ELI