固定化酶催化反应过程

第1页，课件共119页，创作于2023年2月1、水溶性酶应用过程中的一些不足酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶(如α-淀粉酶、Taq酶等)及可以耐受较低的pH条件(胃蛋白酶等)以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。固定化酶、概述:第2页，课件共119页，创作于2023年2月通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到约束（完全或局部）的一种不溶于水，但仍具活性的酶。它以固相状态作用于底物进行催化反应。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术2、固定化酶（固相酶或水不溶酶）：第3页，课件共119页，创作于2023年2月3、固定化酶的研究历史固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilizedenzyme。第4页，课件共119页，创作于2023年2月优点:(1)

在催化反应以后，固定化酶容易从反应系统 中分离出来，可以反复使用，固定化后的酶 大多数情况下其稳定性增加.(2)

产物不受污染,容易精制;(3)固定化酶有一定的形状和机械强度，可以装 填在反应器中长期使用，便于实现生产连续 化和自动化。缺点：

(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。

(2)酶活性下降。4、固定化酶的优缺点：第5页，课件共119页，创作于2023年2月固定化酶在工业生产中的应用: 5、固定化酶应用:泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化氨基酸酰化酶生产L-氨基酸;乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala第6页，课件共119页，创作于2023年2月固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆---世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶.第7页，课件共119页，创作于2023年2月固定化酶在生化制药中的应用:固定化的青霉素酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素;固定化谷氨酸脱羧酶可以生产γ-氨基丁酸,制成了CO2电极,可用于测定谷氨酸的含量。固定化酶在医学上的应用:固定化纤溶酶治疗血栓,用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾等第8页，课件共119页，创作于2023年2月固定化酶在分析检测和环境保护中的应用

(生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统,可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质)第9页，课件共119页，创作于2023年2月固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种,将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上,只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检测出尿样的葡萄糖是否超标,从而断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠。生化分析中最常用的H电极也绝大多数是固定化酶产品:固定化青霉素酶电极重组海洛因酯酶传感器检测违禁药品用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BOD。第10页，课件共119页，创作于2023年2月 ——载体结合法、交联法、包埋法.1）载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。物理吸附法离子结合法共价结合法结合的形式6、固定化酶的制备方法:第11页，课件共119页，创作于2023年2月离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。载体:多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。DEAE纤维素、GM纤维素等。特点:操作简单，条件温和，酶活回收率较高,受缓冲液种类或pH的影响，易从载体上脱落。物理吸附法：酶被物理吸附(氢键,疏水键)于不溶性载体的一种固定化方法。载体:活性炭、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、淀粉、合成树脂等。特点:酶活性中心不易被破坏，酶结构变化少，酶与载体相互作用力弱，酶易脱落。第12页，课件共119页，创作于2023年2月共价结合法：酶以共价键结合于载体的固定化方法，是载体结合法中应用最多的一种。将载体有关基团活化，与酶有关基团发生偶联反应；或在载体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、羟基、酚基等。代表性的方法有重氮法、溴化氰法等。特点:反应条件比较苛刻，操作复杂，并引起酶高级结构产生变化，破坏了部分活性中心，酶活回收率为30％左右。第13页，课件共119页，创作于2023年2月用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联的固定化方法。它是利用共价键固定酶的，它不使用载体。交联剂:形成希夫碱的戊二醛、形成肽键的异氰酸酯、发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。特点:结合牢固，可以长时间使用,反应条件较激烈、酶活回收率低,颗粒较小,使用不便。2）交联法：第14页，课件共119页，创作于2023年2月可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。第15页，课件共119页，创作于2023年2月——网格型和微囊型两种。将酶包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。特点:酶的高级结构改变少，酶活回收率较高，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。适于网格型的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明胶、海藻酸等。

3）包埋法第16页，课件共119页，创作于2023年2月微囊型特点:固定化酶颗粒一般为直径是几微米到几百微米的球状体，比网格型颗粒小得多,有利于底物和产物扩散;半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值.但反应条件要求高，制备成本也高。制备方法:界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法和脂质体包埋法等.第17页，课件共119页，创作于2023年2月脂质体包埋：这是一种采用表面活性剂和磷脂酰胆碱等物质，形成液膜来包埋酶的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体,

具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。第18页，课件共119页，创作于2023年2月第19页，课件共119页，创作于2023年2月固定化方法吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备难易易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变第20页，课件共119页，创作于2023年2月发展方向:将酶固定在生物膜或超滤膜上,制造出来的生物膜反应器;固定化细胞技术注:通过不同方法制得的固定化酶，必须制成不同型式的组件装在反应器中进行酶催化反应，例如制成颗粒状、膜状、管状(中空纤维)。第21页，课件共119页，创作于2023年2月酶的固定化，不仅使酶的活性发生了变化，而且由于固定化酶使反应体系变为多相体系，例如液一固体系,气-液-固等，因此研究需结合以下两个方面:考虑酶催化反应的本征动力学规律;研究反应物的质量传递规律，及其对酶催化反应过程的影响。固定化酶催化反应动力学本质宏观动力学方程:同时包括物质传质速率和催化反应速率的动力学方程。是设计固定化酶催化反应器和确定其操作条件的理论基础。第22页，课件共119页，创作于2023年2月溶液酶→固定化酶，其性质将会发生很大的变化。这种变化因酶的种类、所催化的反应、所用的载体和采用的固定化方法的不同而不同。3．1固定化酶催化的动力学特征

一、酶的固定化对其动力学特性的影响(1)活性的变化。固定化时，部分酶未被固定而残留在溶液中，造成了酶的部分损失；同时由于各种原因也会造成已被固定化的酶的活性有所下降。固定化酶的动力学仍服从M—M方程，可通过米氏常数K反映酶在固定化前后活性的变化。第23页，课件共119页，创作于2023年2月某些游离酶和固定化酶的米氏常数酶固定化试剂底物Km/(mol/L)肌酸激酶无对氨苯基纤维素ATPATP6.5×10-48.0×10-4乳酸脱氢酶无丙酰-玻璃NADHNADH7.8×10-65.5×10-5-糜蛋白酶无可溶性醛葡聚糖ATEEATEE1.0×10-31.3×10-3无花果蛋白酶无CM-纤维-70BAEEBAEE2×10-22×10-2胰蛋白酶无马来酸/1,2-亚乙基BAABAA6.8×10-32×10-4ATP-三磷酸腺苷;NADH-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;ATEE-N-乙酰-L-酪氨酸乙酯;BAEE-N-苯酰精氨酸乙酯;BAA-苯酰精氨酰胺大多数酶在固定化后，其Km值增加，表示催化反应活性将下降。也有少数酶固定化后活性无变化，甚至有所增大。第24页，课件共119页，创作于2023年2月评价活性变化的两种指标：酶活力表现率和酶活力收率。酶活力表现率：实际测定的固定化酶的总活力与被固定化了的酶在溶液状态时的总活力之比。酶活力收率：实际的固定化酶的总活力与固定化时所用的全部游离酶的活力之比。活力表现率=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100%活力收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%第25页，课件共119页，创作于2023年2月半衰期:在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。理论推测酶固定化后，其半衰期将增加一倍。热稳定性:也有所提高，要比溶液酶提高10多倍。这是因为酶固定化后，酶的空间结构变得更为坚固，加热时不易变形，增加了酶的热稳定性。酶被固定化后，其稳定性有所增加，保存和使用时的稳定性均有提高。(2)稳定性的变化:第26页，课件共119页，创作于2023年2月构象效应：酶在固定化过程中，由于酶和载体的相互作用，引起了酶的活性部位发生某种扭曲变形，改变了酶活性部位的三维结构，减弱了酶与底物的结合能力的现象。屏蔽效应（位阻效应）：载体的存在使酶分子的活性基团不易与底物相接触，从而对酶的活性部位造成了空间障碍，使酶的活性下降。如在葡聚糖凝胶上共价交联胰蛋白酶的活性低于结合在琼脂糖的活性，原因是葡聚糖凝胶的空间屏障大于琼脂糖。

二、固定化酶动力学的影响因素

(1)空间效应:酶的活性部位和变构部位的性质取决于酶分子的三维空间结构。

第27页，课件共119页，创作于2023年2月当固定化酶处在反应体系的主体溶液中时，反应体系成为固液非均相体系。由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定酶载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象→分配效应。造成了底物浓度在两个环境中的不同，必然使酶的催化反应速率有所不同。

分配效应一般采用液固界面内外侧的底物浓度之比（分配系数）来定量表示。(2)分配效应第28页，课件共119页，创作于2023年2月界面内侧的底物浓度为Csg，界面外侧的底物浓度为Csi,则分配系数K为：K=Csg／CsiCso—液相主体的浓度，Csi——外扩散造成的界面外侧浓度。Csg—由分配效应造成的微环境的底物浓度。第29页，课件共119页，创作于2023年2月静电效应的影响表现在对Km值的影响。通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。底物在溶液中也会离子化，这样在固定载体上的电荷和移动的离子之间，常会发生静电交互作用，产生分配效应。使底物或产物浓度之间出现不均匀分布。根据Boltzman分配定律，分配系数K为Z--底物分子所带电荷；F--法拉第常数；U--静电电势。当载体与底物所带电荷相反时，即Z为正、U为负时，K大于1;当两者带有相同电荷时，则K小于1。第30页，课件共119页，创作于2023年2月对固定化酶催化反应，其底物浓度应取在固定化酶内外表面附近的微环境的数值，根据米氏方程，当Z及U为异号，K'm小于Km；反之，则K'm大于Km

；当任何一方电荷为零时，Km不变。当载体与底物带不同电荷时，Km值减小，反应速率增大；带有相同电荷时Km值增大，反应速率减小。其根源在于使微环境与主体溶液之间的浓度出现了差异。第31页，课件共119页，创作于2023年2月(3)扩散效应：固定化酶对底物进行催化反应时，底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化活性中心处，反应得到的产物必须从酶的催化活性中心传递到主体溶液中。物质的传递过程有分子扩散和对流扩散。扩散过程的速率在某些情况下可能会对反应速率产生限制作用，由于生物物质在液体中的扩散速率相当缓慢，而酶的催化活性又很高时，这种扩散限制效应会相当明显。

第32页，课件共119页，创作于2023年2月扩散限制效应有外扩散和内扩散限制效应。外扩散：底物从液相主体向固定化酶的外表面的一种扩散,或是产物从固定化酶的外表面向液相主体中的扩散。外扩散是发生在催化反应之前或之后。由于外扩散阻力的存在，使底物或产物在液相主体和固定化酶外表面之间存在着浓度梯度。内扩散：指对有微孔载体的固定化酶，底物从固定化酶外表面扩散到微孔内部的酶催化中心处，或是产物沿相反途径的扩散。对底物来讲，内扩散限制与酶催化反应同时进行。第33页，课件共119页，创作于2023年2月由于扩散限制效应的存在，底物浓度从液相主体到固定化酶外表面，再到内表面是依次降低，而产物浓度分布则相反。第34页，课件共119页，创作于2023年2月分配效应造成的结果是使微观环境与宏观环境之间的底物浓度出现了差别，因而影响了酶催化的反应速率。如果在上述本征动力学的基础上，仅考虑由于这种分配效应而造成的浓度差异对动力学产生的影响，所建立的动力学称为固有动力学。动力学方程仍然服从M—M方程形式，仅对动力学参数予以修正。空间效应难以定量描述，它与固定化的方法、载体的结构及性质、底物分子大小和形状等因素有关。这属于酶工程的范围。空间效应的影响可通过校正动力学参数rmax和Km来体现的。在此基础上建立起的动力学方程→本征动力学。本征动力学是指酶的真实动力学行为，包括溶液酶和固定化酶在内。固定化酶的本征动力学与溶液酶的本征动力学是有差别的。第35页，课件共119页，创作于2023年2月扩散效应:固定化酶受到扩散限制时所观察到的速率统称为有效反应速率（宏观反应速率）。由于生化物质在溶液内和固定化酶微孔内的扩散速率是比较慢的，因而扩散阻力是影响固定化酶催化活力的主要因素。并且所建立的宏观动力学方程也不完全服从M—M方程形式。

第36页，课件共119页，创作于2023年2月因此对一个非均相(液一固)体系所建立的宏观动力学方程不仅包括酶的催化反应速率，而且还包括了传质速率。这是固定化酶催化反应过程动力学的最主要特征。对固定化酶催化反应动力学，要考虑固定化酶本身的活性变化和底物等物质的传质速率的影响，而传质速率又与底物等物质的性质和操作条件以及载体的的性质等因素有关。第37页，课件共119页，创作于2023年2月3．2外扩散限制效应固定化酶与液相反应物系相接触时，反应过程包括三步：①底物从液相主体扩散到固定化酶的外表面；②底物在固定化酶的外表面上进行反应；③产物从酶外表面扩散进入液相主体。三步是一串联过程。任意一步的速率发生变化，都影响到整个过程的速率。第38页，课件共119页，创作于2023年2月对非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合M—M方程形式，即Rsi—底物在固定化酶外表面上的消耗速率（宏观反应速率），mol／(L·S)；Csi——底物在固定化酶外表面上的浓度，mol／L。3.2.1外扩散速率对酶催化反应速率的限制第39页，课件共119页，创作于2023年2月底物由液相主体扩散到固定化酶外表面的速率Rsd表示为kL——液膜传质系数，m／s；a——单位体积的物系中所具有的传质表面积;kLa——体积传质系数，s-1；Cso—底物在液相主体中的浓度，mol／L。定态条件下，应存在Rsi=Rsd，第40页，课件共119页，创作于2023年2月该式表示了在定态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表面上底物的反应速率。当外扩散传质速率很快，而固定化酶外表面反应速率相对较慢，并成为该反应过程速率的控制步骤时，则酶的外表面上底物浓度应为液相主体溶液的浓度Cs。此时的反应速率应为第41页，课件共119页，创作于2023年2月存在有Cso=Csi。因此上式为没有外扩散传质速率影响的本征反应速率，或称为在此条件下可能达到的最大反应速率rso。当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应速率很快，此时外扩散速率成为反应的控制步骤。固定化酶外表面上底物浓度趋于零。→Rsi=kLaCso=rd第42页，课件共119页，创作于2023年2月Rso~Cso----非线性Rd~Cso----线性当Cso值较低时，rso>rd，为外扩散控制，→Rsi=rd当Cso值较高时，rso<rd，为动力学控制，→Rsi=rso第43页，课件共119页，创作于2023年2月当Cso处于中间范围，称为过渡区，反应速率与扩散速率相差不大。要求取有外扩散影响下的反应速率，即宏观反应速率Rsi,可采用两种方法求出。(1)由Csi值确定Rsi。定义上式表示为第44页，课件共119页，创作于2023年2月——无因次准数，常称Damkohler(丹克莱尔)准数。求解可得当a>0，括号内取“+’’号；当a<0，则应取“一’’号。求出Csi值，再求出宏观反应速率Rsi值。

第45页，课件共119页，创作于2023年2月Da是一个无因次数群。其物理意义为：当Da<<l时，酶催化最大反应速率要低于底物的扩散速率。此时为反应动力学控制。当Da>>l时，则底物最大扩散速率要低于酶催化底物的反应速率，此时该反应过程为传质扩散控制。底物在固定化酶外表面处的浓度应同时满足传质速率方程式和反应速率方程式，因此可通过作图法求出Csi值和相应的速率值。第46页，课件共119页，创作于2023年2月图中曲线1为底物S的反应本征动力学曲线；直线2为传质速率方程；直线斜率为kLa；直线与曲线交点为方程的解，对应横坐标值为其表面底物浓度Csi，交点对应的纵坐标值为所求的表面反应速率Rsi。第47页，课件共119页，创作于2023年2月如果是带电的固定化酶放在电离了的底物溶液中，则表示外扩散速率影响的宏观速率应为λ-与静电分布有关的参数，M-修正系数第48页，课件共119页，创作于2023年2月（2）外扩散有效因子ηE，求RSi值。

ηE的定义为：用无因次形式得：有外扩散影响时的实际反应速率为：第49页，课件共119页，创作于2023年2月当时，Rsi≈rso，表明固定化酶外表面处底物浓度与液相主体浓度相同，反应没有受到外扩散传质速率的限制影响；当时，则表明由于外扩散传质速率较慢，已在某种程程度上限制了反应速率；当时，则宏观反应速率实际上由外扩散传质速率所控制。当反应过程为外扩散控制时，Da>>l，有：

第50页，课件共119页，创作于2023年2月此时反应宏观速率可表示为：Rsi=kLaCs0——一级反应动力学当反应过程为动力学控制时，Da<<1，有：Rsi=rso为了使尽可能增大到1，应控制操作条件使Da值尽可能小，即提高kLa值。一个有效的方法是提高液体流速。在消除了外扩散的影响时所测得的宏观反应速率实际上反映了本征反应速率。

第51页，课件共119页，创作于2023年2月引入无因次底物液相主体浓度为

不同β值下，与Da的关系表示如图

当Da和β已知，可确定但需要已知其本征动力学参数rmax和Km，而这些参数又是不受外扩散影响的反应中求得的第52页，课件共119页，创作于2023年2月引入可观察的丹克莱尔准数

式中没有反应的本征动力学参数。用来求值要比用Da更为方便。知故第53页，课件共119页，创作于2023年2月在不同β值下，与作图。用该图很容易由值确定值。第54页，课件共119页，创作于2023年2月外扩散对反应过程速率的影响还可从E—H图看到

当Da值较小时，为动力学控制，该关系表示为一直线；随着Da值的增大，外扩散影响程度在增加，关系曲线明显偏离直线。通过该图可检验外扩散对反应的限制程度。第55页，课件共119页，创作于2023年2月对任意n级反应A—R，本征速率方程为

n=1

第56页，课件共119页，创作于2023年2月3．3内扩散限制效应对包埋或吸附于多孔性载体中的固定化酶，其催化反应发生的主要部位是在颗粒的内部。内扩散的阻力主要是微孔内的阻力。阻力的大小与固定化酶颗粒内部的物理结构参数、反应物系的性质等因素有关。3.3.1载体的结构参数与微孔内的扩散研究内扩散对动力学的影响时，常将均匀分布着酶的多孔球形颗粒为研究模型。先研究颗粒载体的结构参数和流体在载体微孔内的扩散。第57页，课件共119页，创作于2023年2月（1）载体结构参数①比表面积Sg：单位质量载体所具有的内表面积，m2/g。Sg=200~300m2/g。②微孔半径：多孔载体的内表面积与微孔孔径大小有关。孔径愈小、比表面积愈大。如用Vg表示单位质量载体所具有的孔体积，则平均微孔半径为：③孔隙率:载体颗粒内孔隙所占有的体积与该颗粒体积之比值。值恒小于1表观密度:表示了单位颗粒体积中所含有固体的质量。第58页，课件共119页，创作于2023年2月④颗粒当量直径体积相当直径dv:与颗粒体积相等的球体直径来表示外表面积相当直径ds:与颗粒的比表面积相等的球体直径来表示假定某任一形状的固定化酶颗粒，其体积为Vp，外表面积为Ap，各当量直径分别为形状系数（球形度）：与颗粒体积相同的球体的外表面积As与颗粒的外表面积Ap之比值——表示了任意颗粒的外形与球形相接近的程度。第59页，课件共119页，创作于2023年2月⑤颗粒密度颗粒表观密度颗粒真密度颗粒堆密度

第60页，课件共119页，创作于2023年2月(2)液体在微孔内的扩散：

当微孔内流动时，则某一组分的扩散可以认为是以浓度差为推动力而进行的。对于气相分子在微孔内的扩散，则由于微孔半径r与分子运动的平均自由程λ的相对大小不同，微孔内的扩散机理可分为两种：分子扩散（正常扩散）：扩散的阻力来自于分子之间的碰撞，扩散速率主要受到分子之间相互碰撞的影响，与微孔直径的大小无关。努森(Knudson)扩散：其扩散过程的阻力主要是分子与孔壁之间的碰撞，而分子之间的碰撞影响较小。它常发生在微孔直径较小的情况。第61页，课件共119页，创作于2023年2月

当时，→分子扩散；当时，→努森扩散。介于之间属于两种扩散机理并存。液体在微孔内的扩散机理一般为分子扩散。其扩散速率由分子扩散系数决定。微孔内液体分子的扩散速率，可用Fick定律描述：

Ns—组分S的扩散通量，z—沿扩散方向的距离，De—有效扩散系数第62页，课件共119页，创作于2023年2月固定化酶颗粒内部的微孔是弯弯曲曲的，微孔的大小也不均匀，微孔彼此之间可能封闭，也可能连通。因此与在主体溶液中进行的分子扩散相比，扩散阻力明显增大，其扩散系数要比分子扩散系数小。

对于常用固定化酶凝胶，De／D大约为0.5~0.8。但对于微胶囊固定化酶，由于颗粒内亦为液相，因此De≈D。第63页，课件共119页，创作于2023年2月第64页，课件共119页，创作于2023年2月3.3.2

微孔内反应组分的浓度分布在微孔内，由于内扩散阻力的存在，反应组分在微孔内的浓度分布不均匀。底物在固定化酶颗粒的外表面处浓度最高而在颗粒中心处浓度最低，形成浓度分布，而反应产物的浓度分布则与之相反。由于在微孔内扩散与反应同时进行，因而沿着微孔方向，底物的浓度及反应速率同时在下降。要描述浓度及反应速率的变化规律，必须建立包括扩散与反应在内的质量衡算方程式。

第65页，课件共119页，创作于2023年2月对球形固定化酶(1)质量衡算方程：普遍而完整的质量衡算方程应表示为[流入系统的质量]一[离开系统的质量]+[系统内产生的质量]一[系统内消耗的质量]=[系统内累积的质量]第66页，课件共119页，创作于2023年2月对球形颗粒，常用一壳层进行质量衡算，如图所示。球形颗粒半径为R，在距球心为r处取一壳层，其厚度为Δr。底物通过微孔由外向内扩散，并通过此壳层。底物在(r+Δr)处扩散进入，在r处离开，并在壳层内发生酶催化反应而消耗底物。第67页，课件共119页，创作于2023年2月推导质量衡算方程时的七点假设：①固定化酶颗粒是等温的。一般情况下，固定化酶颗粒内的温度梯度是可以忽略的，以简化了模型。②传质机理为扩散效应。一般假定颗粒对流体是不能渗透的，微孔内流体的对流流动也是可以忽略的。这个假设对很多固定化酶是正确的。③扩散效可用费克定律描述。有效扩散系数为一常数。De不依位置的不同而变化。④颗粒是均匀的，不仅其活性分布均匀，载体也是均匀的。第68页，课件共119页，创作于2023年2月⑤底物分配系数是1。对大部分底物和固定化酶，该假设也是正确的。⑥固定化酶颗粒处于稳态之下，即催化活性无变化⑦底物和产物的浓度仅沿r方向而变化。[流入系统的质量]一[离开系统的质量]+[系统内产生的质量]一[系统内消耗的质量]=[系统内累积的质量]第69页，课件共119页，创作于2023年2月根据微分定义得：要得到具体结果，上述方程的解法与动力学rs的形式有关。（2）一级动力学的浓度分布。引入，，令则该方程式变为

第70页，课件共119页，创作于2023年2月边界条件：处，，处，。求浓度分布为该方程通解：根据边界条件求出积分常数

C1和C2。

C1=0

第71页，课件共119页，创作于2023年2月双曲正弦函数

第72页，课件共119页，创作于2023年2月右图表示了不同φ值时的关系曲线，即浓度分布图。对M—M反应，当Cs<<Km时，可做一级反应处理，此时

第73页，课件共119页，创作于2023年2月当φ1值较小时，φ1≤1，扩散速率要明显快于反应速率，因此底物可以扩散进入颗粒中心，并且使底物浓度沿r方向的分布是平坦的。当φ1值较大时，例如φ1≥5，扩散速率要明显慢于反应速率，大部分底物在接近颗粒外表面处消耗掉。如当φ1=5时，在≤0．6处，底物浓度接近于零。第74页，课件共119页，创作于2023年2月

(3)零级动力学的浓度分布对零级反应动力学，可得：

(Cs>0)对M—M反应，当Cs>>Km时，可做零级反应处理，此时k0=rmax。对零级反应动力学，反应速率与底物浓度高低无关，仅与k0有关。第75页，课件共119页，创作于2023年2月如果由于内扩散阻力较大,造成了固定化酶颗粒内部在球心O到某一位置Rc处之间无底物存在，即Cs=0，这对固定化酶催化能力产生影响。解方程得到边界条件：处，Cs=Cs0，

处，第76页，课件共119页，创作于2023年2月方程的解当Cs>0时才是正确的。通过上式可求出Cs=0时的临界半径Rc值。当Cs=0时，

第77页，课件共119页，创作于2023年2月Rc→临界半径，在r<Rc处无底物存在，也无反应发生。在0<r<Rc处，催化剂并未得到利用。为了节省固定化酶，其颗粒大小应做成保证在球心处，即r=0处，正好Cs=0，此时求得半径称为最大颗粒半径Rmax：只要颗粒半径R≤Rmax，就可保证颗粒内Cs>0。第78页，课件共119页，创作于2023年2月(4)M—M动力学的浓度分布对M—M反应动力学，可得：无因次参数:

第79页，课件共119页，创作于2023年2月边界条件为外表面处中心处该方程描述了球形固定化酶微孔内底物浓度与扩散距离的关系。只能用数值法求解。得到如图所示的关系曲线。对同一位置处，随着φm值的增加，底物浓度在减少;表明着内扩散阻力的增大，底物浓度下降；

第80页，课件共119页，创作于2023年2月对同φm值，当，1,当，为最低值,即愈往颗粒内部，底物浓度愈小。

当扩散速率较快时,Cs可以到达颗粒中心处，此时Rc=0；当扩散速率较慢时,底物在还未达到颗粒的中心处已反应掉，在r<Rc处，Cs=0,此时Rc>0。第81页，课件共119页，创作于2023年2月不同固定化酶动力学的浓度分布公式第82页，课件共119页，创作于2023年2月3.3内扩散有效因子在球形固定化酶内底物浓度的分布反映了内扩散阻力对浓度分布的影响，为求出内扩散阻力对反应速率的影响，要能定量地算出考虑内扩散影响时的有效反应速率。引入内扩散有效因子η概念如果不存在外扩散影响，则Csi=Cs0，表面浓度等于液相主体浓度，即Rsi=Rso。第83页，课件共119页，创作于2023年2月有内扩散影响时的反应速率：在无外扩散影响时，可表示为(1)一级动力学的有效因子：当无内外扩散影响存在时，一球形固定化酶总的本征反应速率可表示为：

第84页，课件共119页，创作于2023年2月对球形固定化酶颗粒，在稳态条件下，颗粒内实际有效反应速率应等于从颗粒外表面向微孔内的扩散速率。第85页，课件共119页，创作于2023年2月又知：

则有得——球形固定化酶催化一级不可逆反应的有效因子第86页，课件共119页，创作于2023年2月不同形状固定化酶的η1~1关系曲线随着梯勒模数1的增加，有效因子η1下降，说明内扩散对速率的限制效应增大；当1<0.4时，η1≈1，动力学控制；当1>3时，

，内扩散控制;当0.4<1<3时，为过渡区。第87页，课件共119页，创作于2023年2月固定化酶的几何形状的不同，对其η1与1

的关系的影响实际上是不大的，图上三条曲线几乎重合。特别是当1值较小或较大时更为明显。在计算不同几何形状固定化酶催化一级不可逆反应的有效因子时，先分别求出不同形状时的梯勒模数值，再求出不同形状固定化酶的有效因子，这样做不会带来大的误差。第88页，课件共119页，创作于2023年2月(2)零级动力学的有效因子。根据零级反应的动力学特点，只要在整个球形固定化酶颗粒内有底物存在，而不管其浓度高低，都存在有：如果由于内扩散限制的影响，使得底物在颗粒某一位置Rc处，Cs=0，反应速率也为零。球形颗粒的无活性区第89页，课件共119页，创作于2023年2月此时，该球形颗粒实际反应速率应为：Thiele模数来求值。对球形固定化酶

第90页，课件共119页，创作于2023年2月当0<0≤0.577时，颗粒内Cs>0，0=1；当0>0.577时，0与0有下述关系：第91页，课件共119页，创作于2023年2月随着0的增大，0下降。图表示了对零级反应动力学的0与0

关系曲线。

第92页，课件共119页，创作于2023年2月不同动力学与几何形状时η~关系式第93页，课件共119页，创作于2023年2月由于M—M反应动力学时非线性的特点,不能求得颗粒内浓度分布的解析解，也不能求得有效因子的解析解。一般采用数值解方法。

图为对片状固定化酶催化剂进行M—M反应动力学时与的关系曲线，的定义见表3-4。该曲线通过数值解而得到。(3)M—M动力学的有效因子。第94页，课件共119页，创作于2023年2月M值介于0和1之间，准确的结果取决于β值。当β=∞→零级动力学；当β=0→一级动力学。当β值处于上述两种情况之间,则需要用数值解来求其M值。如果已经有了m一m的曲线图，则可利用公式直接求出m值，再利用有关图，就可求出M值。第95页，课件共119页，创作于2023年2月也可用近似公式求其M值。对膜状固定化酶，a=b=1；对球形固定化酶，a=2.6，b=0.8。第96页，课件共119页，创作于2023年2月

梯勒模数是一个重要无因次模型参数。其物理意义为：值愈大，表示内扩散传质速率相对于反应速率较慢，内扩散阻力对反应速率的限制程度就大。值的大小来判断内扩散阻力对酶催化反应的影响程度。(4)梯勒模数(Thielemodulus)的计算第97页，课件共119页，创作于2023年2月对任何反应动力学和任何形状的固定化酶，普遍化的梯勒模数Vp-固定化酶颗粒体积，Ap-固定化酶颗粒外表面积rsi|Csi—Cs=Csi时的反应速率；Cseq——平衡时底物浓度，对不可逆反应Cseq=0。不同动力学和不同形状的固定化酶催化反应的梯勒模数计算公式，具体见表第98页，课件共119页，创作于2023年2月m的定义第99页，课件共119页，创作于2023年2月结论:①颗粒大小(或厚度)→特性尺寸。该值愈大、值也愈大，则值下降。为了减少内扩散限制效应，应尽可能采用小颗粒固定化酶。②微孔孔径大小:若能增大De值，可使减小，值增大,内扩散限制效应减轻。提高De值的重要手段是增大微孔孔径，以减少底物或产物在微孔内的扩散阻力。从减小内扩散限制效应角度考虑，固定化酶宜采用小粒度大孔径。第100页，课件共119页，创作于2023年2月③当动力学参数k0、k1和rmax值增加时,值增大，→值下降。由于动力学参数值的增大，使内扩散限制效应的影响程度相对加大。需要指出:在值公式中所有采用的动力学参数为本征动力学参数，这些参数的数值必须是在无内外扩散影响下所测得的值。所用浓度表示为颗粒外表面浓度Csi，这是在有外扩散时的浓度，若不考虑外扩散影响，则可用Cs。(液相主体浓度)表示。包括β值、可用Cso／Km表示。第101页，课件共119页，创作于2023年2月在确定有效因子所有方法中，都需要预先已知其反应的本征动力学参数，为此必须在已消除内外扩散影响的前提条件下进行动力学实验才能求得、给动力学实验带来了麻烦。引入表观梯勒模数方法表观梯勒模数的定义式为：在无外扩散影响下，Csi可用Cso表示。Rs为内扩散影响